DNA甲基化實(shí)驗(yàn)

一、DNA甲基化介紹

　　DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyl-transferase,Dnmts）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應(yīng)。DNA甲基化通常抑制基因表達(dá)，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)，這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。

二、DNA甲基化檢測(cè)方法

　　1、甲基化特異性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

　　用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過電泳檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說明該位點(diǎn)存在甲基化；反之，說明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化。

　　2、亞硫酸氫鹽測(cè)序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

　　用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，最后將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測(cè)序，就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化，這種方法稱為BSP-克隆測(cè)序法。

三．實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示

MSP：

M:2000maker:2000bp:1000bp:750bp:500bp:250bp:100bp

1:5CA-M

2: 5CA-U

3:12CA-M

4:12CA-U

5:26CA-M

6:26CA-U

BSP：

四、送樣運(yùn)輸要求：

　　動(dòng)物組織：新鮮的組織量100 mg(黃豆大小)，最少50 mg（綠豆大?。?，干冰運(yùn)輸。

　　細(xì)胞：1×10^6個(gè)細(xì)胞，收集細(xì)胞沉淀，干冰運(yùn)輸。

　　全血：最少1 mL新鮮血液EDTA抗凝管，-20度運(yùn)輸。