主要用途

    組織CDK2/CYCLIN A激酶活性光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)多肽底物，在CDK2/CYCLIN E抑制劑的存在下，受到CDK2/CYCLIN A磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定產(chǎn)生ADP過(guò)程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光度法測(cè)定其氧化后峰值的變化，以分析組織裂解樣品中CDK2/CYCLIN A特異活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或純化酶樣品中CDK2/CYCLIN A激酶的特異活性定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶(hù)自備

CDK2/CYCLIN A激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 待測(cè)樣品準(zhǔn)備

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重100至500毫克組織重量

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗

4． （選擇步驟）抽去清理液

5． 移入到一個(gè)液氮凍存管

6． 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜

7． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）

8． 放進(jìn)一個(gè)1.5毫升離心管

9． 加入置于冰槽里的xx至xx微升裂解液（Reagent B） 

10． 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻

11． 放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/span>

12． 即刻放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g

13． 小心移取上清液到新的無(wú)菌的1.5毫升離心管

14． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

15． 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如組織裂解懸液等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘）或0分鐘和5分鐘各測(cè)讀一次，并置零

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入xx微升陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘

四、 樣品測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入10微升待測(cè)樣品（注意：50微克組織裂解蛋白；樣品須溶解）

7. 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

        8.即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘。

五、 酶標(biāo)儀測(cè)定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里

3． 分別加入xx微升酶促液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

5． 分別加入xx微升底物液（Reagent F）

6． 輕輕搖動(dòng)96孔板

7． 在30℃溫度下孵育3分鐘

8． 分別加入xx微升陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（50微克組織裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動(dòng)96孔板

10． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

11． 活性計(jì)算：

六、抑制劑篩選

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、活性和待測(cè)抑制劑樣品

2． 按下表加入試劑，進(jìn)行樣品預(yù)處理

3 3.3.3.3.分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里

4． 分別加入xx微升酶促液（Reagent D）

5． 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

6． 分別加入xx微升底物液（Reagent F）

7． 輕輕搖動(dòng)96孔板

8． 在30℃溫度下孵育3分鐘

9． 加入40微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品

10 即刻放進(jìn)30℃酶標(biāo)儀檢測(cè)：測(cè)讀0分鐘和30分鐘

11 實(shí)際讀數(shù)：0分鐘讀數(shù)—30分鐘讀數(shù)

12 抑制活性計(jì)算：