蛋白磷酸化/去磷酸化是一種非常重要且廣泛的細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制，許多酶、受體蛋白都是通過激酶/磷酸酶的磷酸化/去磷酸化來調(diào)節(jié)其功能的激活或抑制。特別是蛋白激酶負(fù)責(zé)大量細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，并與腫瘤、自身免疫病、炎癥性疾病、退行性神經(jīng)疾病等有著密切關(guān)聯(lián)。因此蛋白激酶和蛋白磷酸酶也是非常重要的熱門藥物靶點(diǎn)，且對(duì)應(yīng)的新型藥物形式也不斷被開發(fā)。

蛋白激酶(Protein Kinases)和蛋白磷酸酶 (Phosphatases) 的區(qū)別

蛋白激酶是將ATP末端的磷酸基團(tuán)(PO4)轉(zhuǎn)移到含有羥基的底物蛋白氨基酸殘基上，從而實(shí)現(xiàn)磷酸化過程。蛋白磷酸化是最常見且最重要的翻譯后修飾（PTMs）之一，在真核生物中，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸是主要的磷酸化位點(diǎn)，特別是絲蘇氨酸的占比非常大，酪氨酸磷酸化相對(duì)較少。通常依據(jù)激酶對(duì)于底物氨基酸的選擇性，可將蛋白激酶分為絲/蘇氨酸激酶和酪氨酸激酶。

而磷酸酶與蛋白激酶功能相反，它是通過將磷酸單酯水解成一個(gè)磷酸基團(tuán)和一個(gè)帶有游離羥基的分子來去除磷酸化的蛋白質(zhì)上的磷酸基團(tuán)。去磷酸化作用同樣主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上。

蛋白激酶 (Protein Kinases)藥物研發(fā)策略

至今，全球已獲批的蛋白激酶抑制劑藥物靶點(diǎn)約占已知人類激酶組類型的20%，因此新型激酶藥物的開發(fā)仍有巨大空間。

基于生化水平的激酶抑制劑高通量篩選

使用HTRF/LANCE（均相時(shí)間分辨熒光）技術(shù)可實(shí)現(xiàn)激酶抑制劑的高通量篩選。（圖2所示），該方法將銪標(biāo)記于識(shí)別底物磷酸化的抗體上，作為 “供體” 熒光分子。而在多肽底物上標(biāo)記 “受體” 熒光分子，當(dāng)多肽底物被磷酸化時(shí)，就能夠被抗體識(shí)別，從而產(chǎn)生FRET信號(hào)。

如下（圖3）中MELK激酶活性的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，在優(yōu)化好反應(yīng)條件之后，即可利用該檢測(cè)方法篩選激酶抑制劑，測(cè)出星形孢菌素對(duì)MELK的IC50為9.8nM左右。

基于細(xì)胞水平的激酶抑制劑高通量篩選

細(xì)胞激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)控許多重要的細(xì)胞過程，如細(xì)胞存活、分化和凋亡。激酶信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的典型特征是多個(gè)激酶排列在級(jí)聯(lián)中。HTRF/ALPHA技術(shù)已經(jīng)開發(fā)用于研究激酶信號(hào)通路，以及篩選化合物文庫(kù)以尋找修飾受體或激酶活性。如（圖4）所示，使用ALPHA技術(shù)在A375細(xì)胞上測(cè)試兩款激酶抑制劑 (MEK抑制劑：U0126和PD 98059) ，檢測(cè)其對(duì)pERK和pAKT的產(chǎn)生的抑制能力，分別測(cè)得U0126 的IC50為28.7 nM，PD 98058的IC50為0.66 μM。

蛋白磷酸酶 (Phosphatases)的研發(fā)策略

LANCE技術(shù)可以檢測(cè)絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸磷酸酶的活性。使用ULight標(biāo)記的磷酸化肽作為酶底物，通過檢測(cè)肽的去磷酸化的信號(hào)來表征磷酸酶反應(yīng)活性，磷酸酶抑制劑會(huì)部分或全部恢復(fù)原來的TR-FRET信號(hào)。（圖5）使用磷酸化的ULight標(biāo)記肽4E-BP1 (pThr46) 對(duì)PP1A和PP2A磷酸酶進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明信號(hào)減少的模式與使用32P放射性標(biāo)記肽一致，并且LANCE用到的酶量更少，LANCE技術(shù)非常適合于開發(fā)穩(wěn)健和敏感的信號(hào)減少磷酸酶測(cè)定，并用于表征抑制劑的效果。

HTRF激酶活性檢測(cè)試劑盒

胞內(nèi)蛋白檢測(cè)試劑盒

參考文獻(xiàn)

[1] Ardito F, Giuliani M, Perrone D, Troiano G and Lo Muzio L: The crucial role of protein phosphorylation in cell signaling and its use as targeted therapy (Review). Int J Mol Med 40: 271-280, 2017