介紹

細胞凋亡（Apoptosis）通常是指機體細胞在發(fā)育進程中或者受到某些特定因素影響時，經(jīng)由細胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而引發(fā)的一種程序性細胞死亡現(xiàn)象。在細胞凋亡的途徑里，各個事件的發(fā)生具有時序性，依先后順序逐一出現(xiàn)，最終促成凋亡小體的呈現(xiàn)，接著細胞便發(fā)生凋亡。細胞凋亡在胚胎發(fā)育與形態(tài)發(fā)生、維持組織內(nèi)正常細胞群體的穩(wěn)定、機體的防御及免疫反應(yīng)、疾病或中毒引發(fā)的細胞損傷、老化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面都起著至關(guān)重要的作用，并且具備潛在的治療價值。

圖1：細胞凋亡途徑各時序性事件

檢測原理

正常細胞膜的磷脂分布是不對稱的，活細胞中磷脂酰絲氨(phosphatidylserine, PS)位于細胞膜的內(nèi)表面，細胞凋亡時，細胞膜發(fā)生變化，PS從細胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細胞膜的外表面。Annexin V是一種對PS有高度親和力的、鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，Annexin V可以特異性地識別凋亡細胞表面的PS，而活細胞的PS位于細胞膜的內(nèi)表面，無法與Annexin V特異性結(jié)合。

壞死細胞的PS也會從細胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細胞膜的外表面，Annexin V也能識別壞死細胞表面的PS，所以Annexin V無法區(qū)分壞死細胞和凋亡細胞。而PI染料能夠與細胞內(nèi)的DNA結(jié)合，區(qū)分壞死細胞和活細胞。早期凋亡細胞和活細胞的細胞膜仍然完整，PI染料無法自由通過細胞膜進入細胞內(nèi)與DNA結(jié)合，所以PI染料無法標(biāo)記凋亡細胞和活細胞，而PI染料卻能夠通過壞死細胞的細胞膜與細胞內(nèi)的DNA結(jié)合，壞死細胞內(nèi)PI染料被488nm激光激發(fā)后會發(fā)射紅熒光，被相應(yīng)通道接收。所以Annexin V和PI同時使用，就可以區(qū)分活細胞、早期凋亡細胞和晚期凋亡或壞死細胞。

圖2 Annexin V / PI檢測原理

流式細胞術(shù)檢測

FITC最大激發(fā)波長為488 nm，最大發(fā)射波長525 nm，F(xiàn)ITC的綠色熒光在FL1通道檢測；PI-DNA復(fù)合物的最大激發(fā)波長為535 nm，最大發(fā)射波長為615 nm，PI的紅色熒光在FL2或FL3通道檢測。用CellQuest等軟件進行分析，繪制雙色散點圖，F(xiàn)ITC為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)。典型的實驗中，細胞可以分成三個亞群，活細胞僅有很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光，晚期凋亡細胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

圖3 流式結(jié)果分析

常見問題

Q：Annexin V 細胞凋亡檢測可以應(yīng)用到植物或是細菌（原核生物）嗎？

A：可以，但是需要制備原生質(zhì)體，因為植物細胞或是細菌（原核生物）含有細胞壁，具體的染液使用劑量只需浸沒細胞即可，染色時間對于不同細胞有一定的不同。

Q：實驗結(jié)果如何判斷？

A：活細胞（Annexin V-/PI-）、早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）、晚期凋亡細胞和壞死細胞呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）、裸核（Annexin V-/PI+）。

Q：Annexin V和TUNEL有什么區(qū)別？

A：末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 dUTP 缺口末端標(biāo)記 (TUNEL) 是一種染色方法，用于識別細胞內(nèi) DNA 片段化位點——晚期細胞凋亡的標(biāo)志性特征。

Annexin V 染色通過結(jié)合由于細胞膜不對稱性喪失而暴露在細胞外的 PS 殘基來識別細胞凋亡的早期階段。

Q：是否可以僅使用Annexin V-FITC進行檢測而不檢測PI？

A：可以的。對于特殊的檢測樣本，如紅細胞無細胞核，或使用藥物Doxorubicin（阿霉素）對PI檢測存在干擾，對于這兩種情況可以僅使用Annexin V-FITC進行檢測。

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