逆轉(zhuǎn)錄酶，1970年由Temin和Baltimore獨(dú)立發(fā)現(xiàn)，它能將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，二人因此獲1975年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。逆轉(zhuǎn)錄酶包含多個(gè)功能域，分別為聚合酶域和RNase H域，其中聚合酶域進(jìn)一步細(xì)分為“手指”、“手掌”和“拇指”三個(gè)亞域，分別參與模板結(jié)合、催化反應(yīng)和結(jié)構(gòu)支持[1]。在分子生物學(xué)中，尤其分子診斷領(lǐng)域，逆轉(zhuǎn)錄酶bu  ke  huo  que。它可將病毒RNA基因組轉(zhuǎn)為cDNA，再通過(guò)RT-qPCR、RT-LAMP、RNA測(cè)序等技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，這一特性使得對(duì)諸如艾滋病、甲型流感以及乙型流感這類(lèi)RNA病毒進(jìn)行準(zhǔn)確診斷成為可能。

圖1. 逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白結(jié)構(gòu)及其活性[2]

目前M-MLV（莫洛尼鼠白血病病毒）逆轉(zhuǎn)錄酶是分子診斷試劑中常用的逆轉(zhuǎn)錄酶，然而，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶在高溫條件下表現(xiàn)出相對(duì)較低的穩(wěn)定性，易發(fā)生失活現(xiàn)象。這一特性不僅對(duì)由其配制的預(yù)混液在長(zhǎng)期儲(chǔ)存過(guò)程中的性能保持構(gòu)成挑戰(zhàn)，同時(shí)也限制了其在需要較高溫度下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的應(yīng)用，因此提升逆轉(zhuǎn)錄酶的穩(wěn)定性是一個(gè)重要研究方向。

翌圣團(tuán)隊(duì)?wèi){借其子公司鎂孚泰生物ZymeEditor™創(chuàng)新型酶進(jìn)化平臺(tái)，通過(guò)一系列干濕實(shí)驗(yàn)的交互篩選，成功獲得了穩(wěn)定性提高的M-MLV突變體。在研發(fā)階段，團(tuán)隊(duì)一方面采用了理性/半理性設(shè)計(jì)的策略，對(duì)MMLV進(jìn)行了多維度、多層次的結(jié)構(gòu)-功能分析?；谛蛄幸恢滦苑治?、B-factor分析、吉布斯自由能變化分析以及二硫鍵設(shè)計(jì)等手段，確定結(jié)構(gòu)中的熱點(diǎn)氨基酸，并設(shè)計(jì)能夠穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的定點(diǎn)突變，輸出穩(wěn)定性提升的M-MLV優(yōu)勢(shì)突變體。

圖2. 理性與半理性設(shè)計(jì)改造M-MLV穩(wěn)定性：(A) 理性與半理性設(shè)計(jì)及篩選過(guò)程；(B) 突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)；(C)加速穩(wěn)定性表征數(shù)據(jù)

接著，團(tuán)隊(duì)利用MTPS高通量篩選技術(shù)，對(duì)穩(wěn)定性、RNA/DNA催化的偏好性以及活力都進(jìn)行了多維度篩選，最終獲得了具有性能提升的優(yōu)勢(shì)突變體。通過(guò)對(duì)這些突變體進(jìn)行精細(xì)純化，并對(duì)其性能進(jìn)行全面的酶學(xué)表征，最終成功獲得了多個(gè)cDNA產(chǎn)量顯著提升（接近3倍）的突變體。而且M-MLV突變體與對(duì)照WT的預(yù)混液保存6個(gè)月和12個(gè)月后的建庫(kù)產(chǎn)量對(duì)比數(shù)據(jù)表明，M-MLV突變體的建庫(kù)產(chǎn)量?jī)?yōu)于對(duì)照WT，說(shuō)明M-MLV突變體穩(wěn)定性更優(yōu)。

圖3. (A) 改造RNA和DNA依賴的DNA聚合酶活性提高cDNA產(chǎn)量; (B) M-MLV突變體與對(duì)照WT的cDNA產(chǎn)量對(duì)比; (C) M-MLV突變體與對(duì)照WT的預(yù)混液保存6個(gè)月和12個(gè)月后的建庫(kù)產(chǎn)量對(duì)比

團(tuán)隊(duì)的這項(xiàng)研究獲得了多個(gè)穩(wěn)定性和cDNA產(chǎn)量提升的M-MLV突變體，為分子診斷試劑的開(kāi)發(fā)提供了新的解決方案。通過(guò)對(duì)這些進(jìn)化突變體進(jìn)行全面的性能評(píng)估，包括加速穩(wěn)定性測(cè)試、預(yù)混試劑的穩(wěn)定性、靈敏度分析以及凍干技術(shù)的應(yīng)用，我們精心挑選出綜合性能的突變體進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

今天我們隆重推出通過(guò)酶定向進(jìn)化而來(lái)的新品逆轉(zhuǎn)錄酶：Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶（Cat#14614）。這款新型逆轉(zhuǎn)錄酶在穩(wěn)定性方面實(shí)現(xiàn)了顯著提升，同時(shí)其合成cDNA的產(chǎn)量、靈敏度也達(dá)到了更高的水平。此外，該產(chǎn)品由UCF.ME®超潔凈分子酶生產(chǎn)基地生產(chǎn)，整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程對(duì)物料、環(huán)境、工藝、過(guò)程、質(zhì)量等多環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格把控，確保極低的背景菌gDNA殘留和核酸酶殘留，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性提供了更有力的保障。

Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶能夠保證在低濃度模板情況下，搭配快速程序（逆轉(zhuǎn)錄2 min）,仍能擴(kuò)增特異性靶標(biāo)，且Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶和同類(lèi)競(jìng)品A相比，Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)四個(gè)靶標(biāo)的檢測(cè)Ct值及熒光增幅，均優(yōu)于競(jìng)品A。對(duì)于低濃度樣本，也可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)檢測(cè)，達(dá)到早篩早診的目的。

圖4. Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶和競(jìng)品A性能比較

使用Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶和競(jìng)品A，搭配相同的反應(yīng)buffer，將HRV靶標(biāo)3種型別引探與所有試劑組分提前預(yù)混，在37℃條件下放置5天，與-20℃正常保存的試劑，同時(shí)檢測(cè)濃度為300 copies/µL的模板，結(jié)果顯示，競(jìng)品A在熱加速處理后出現(xiàn)Ct值延后、熒光值降低的現(xiàn)象，而Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶在37℃加速5天后，與-20℃正常保存的試劑相比，擴(kuò)增曲線峰形、熒光值、Ct值都沒(méi)有變化，Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶配制成的全預(yù)混體系穩(wěn)定性更高，可解決當(dāng)前全預(yù)混體系在長(zhǎng)期儲(chǔ)存過(guò)程中的性能難保持的問(wèn)題。

圖5. Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶和競(jìng)品A全預(yù)混穩(wěn)定性比較

Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶除了能夠保證在液體狀態(tài)下的性能，其對(duì)應(yīng)無(wú)甘油酶用于凍干后，依然能保持其優(yōu)異性能。下圖為Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶和競(jìng)品A分別配制成全預(yù)混體系凍干后性能測(cè)試結(jié)果，結(jié)果顯示Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶配制成全預(yù)混體系凍干后對(duì)靶標(biāo)的檢測(cè)Ct值及熒光增幅，均優(yōu)于競(jìng)品A。

圖6. Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶和競(jìng)品A凍干后性能比較

在診斷試劑開(kāi)發(fā)過(guò)程中，由于市場(chǎng)上的分子酶原料的質(zhì)量良莠不齊，核酸殘留過(guò)高會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和準(zhǔn)確性。經(jīng)過(guò)實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，分子診斷關(guān)鍵酶原料只有在核酸殘留極低（如Taq DNA聚合酶HCD ≤ 0.001copies/U）甚至達(dá)到無(wú)檢出的水平才能滿足日益提升的體外診斷試劑的性能需求。翌圣使用E. coli殘留檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶，三批次Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶E. coli檢測(cè)結(jié)果均為未檢出，符合E. coli基因組DNA殘留＜0.02 copies/ 100 U標(biāo)準(zhǔn)，高標(biāo)準(zhǔn)的分子酶原料有助于提高樣本的檢測(cè)可靠性。

圖7. Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶E. coli基因組DNA殘留檢測(cè)結(jié)果

Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶能夠保證在不同濃度RNA模板投入時(shí)，均能獲得優(yōu)異的文庫(kù)產(chǎn)量，且得到的文庫(kù)大小一致，說(shuō)明除RT-PCR/qPCR應(yīng)用外，該酶同樣適用于NGS建庫(kù)。

圖8. Hifair UCF. ME® Advanced逆轉(zhuǎn)錄酶建庫(kù)性能驗(yàn)證

除商業(yè)化逆轉(zhuǎn)錄酶外，翌圣還擁有逆轉(zhuǎn)錄酶突變體庫(kù)，可滿足不同應(yīng)用場(chǎng)景的需求。目前，已有多家合作伙伴對(duì)翌圣鎂孚泰生物改造的逆轉(zhuǎn)錄酶突變體進(jìn)行了試用，得到客戶的高度認(rèn)可。如您對(duì)我們的逆轉(zhuǎn)錄酶突變體感興趣，可掃描下方二維碼聯(lián)系工作人員申請(qǐng)?jiān)囉门?

參考文獻(xiàn)：

[1] Georgiadis M M, Jessen S M, Ogata C M, et al. Mechanistic implications from the structure of a catalytic fragment of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase[J]. Structure, 1995, 3(9): 879-892.

[2] Lown P S, Cai J J, Ritter S C, et al. Extended yeast surface display linkers enhance the enrichment of ligands in direct mammalian cell selections[J]. Protein Engineering, Design and Selection, 2021, 34: gzab004.