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引言

人促紅細(xì)胞生成素（EPO）是一種重要的糖蛋白藥物，廣泛應(yīng)用于治療貧血等疾病。EPO可以結(jié)合紅系祖細(xì)胞上的相應(yīng)受體促進(jìn)紅細(xì)胞的生成，抑制其凋亡，增加紅細(xì)胞的數(shù)量，從而增加機(jī)體的氧氣運(yùn)輸能力。然而，EPO的療效和安全性與其N(xiāo)-連接糖基化（N-glycosylation）密切相關(guān)。N糖結(jié)構(gòu)的微小變化可能直接影響EPO的生物學(xué)活性、穩(wěn)定性和免疫原性。[1,2]因此，N糖測(cè)定成為EPO質(zhì)量控制中不可或缺的一環(huán)。今天，我們就來(lái)聊聊N-糖測(cè)定的重要性，以及高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法（HPAEC-PAD）在這一領(lǐng)域中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

圖1. EPO的結(jié)構(gòu)

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1. EPO的N糖測(cè)定為何如此重要？

a影響生物學(xué)活性

EPO的N糖結(jié)構(gòu)直接影響其與紅細(xì)胞生成素受體的結(jié)合能力，進(jìn)而調(diào)控其生物學(xué)活性。EPO的3個(gè)N-糖鏈均可包含2-4個(gè)分支，每個(gè)分支末端均可為帶負(fù)電的唾液酸，O-糖鏈也可帶有最多2個(gè)唾液酸，這些唾液酸決定了整個(gè)分子的整體負(fù)電荷，也導(dǎo)致了促紅素整體復(fù)雜的電荷異質(zhì)性。唾液酸摩爾數(shù)量的增加可以增加促紅素的半衰期。

b決定藥代動(dòng)力學(xué)特性

N糖鏈中的唾液酸含量與EPO在體內(nèi)的半衰期密切相關(guān)。唾液酸化程度高的EPO能夠避免被肝臟快速清除，從而延長(zhǎng)藥效。

c確保穩(wěn)定性和安全性

N糖鏈可以保護(hù)EPO分子免受降解，并降低其免疫原性。如果N糖結(jié)構(gòu)異常，可能導(dǎo)致EPO聚集或引發(fā)免疫反應(yīng)，影響治療效果。

d監(jiān)控生產(chǎn)工藝一致性

N糖糖譜是EPO質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，能夠反映生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和產(chǎn)品的一致性。

2. HPAEC-PAD用于N糖糖譜測(cè)定的流程

圖2. EPO的N糖測(cè)定流程

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a樣品前處理流程：

● 酶解 取供試品適量，用磷酸鹽緩沖液置換供試品的緩沖體系并制成每 1ml 約含人促紅素蛋白 2.0mg 的溶液。取 100μl，加糖苷酶F溶液 4μl，混勻，置 37℃保溫 16 小時(shí)。

● 除蛋白 加入-20℃預(yù)冷的乙醇 0.3ml，混勻，置-20℃至少 30 分鐘，于 4℃不低于14000g 離心 15 分鐘，取上清液，必要時(shí)采用適宜方式除鹽后真空干燥，加水 0.20ml 復(fù)溶。

b儀器配置及色譜條件：

儀   器：Dionex™ ICS-6000 型離子色譜儀

色譜柱：Dionex™ CarboPac™ PA200 色譜柱；

柱   溫：30℃；

淋洗液：以50mmol/L 氫氧化鈉溶液為流動(dòng)相 A，以 0.2mol/L 氫氧化鈉溶液為流 動(dòng)相 B，以含有 50mmol/L 氫氧化鈉溶液和 0.25mol/L 乙酸鈉溶液為 流動(dòng)相 C，梯度洗脫；

流   速： 0.5ml/min；

檢測(cè)器：脈沖安培檢測(cè)器，金工作電極，Ag-AgCl參比電極，糖四電位波形。

圖3. 高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法測(cè)定EPO中的N糖糖譜（點(diǎn)擊查看大圖）

3. HPAEC-PAD用于N糖糖譜測(cè)定的優(yōu)勢(shì)

高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法（HPAEC-PAD）是目前EPO N-糖和唾液酸測(cè)定中最常用的技術(shù)之一。它的核心優(yōu)勢(shì)在于：

a) 前處理簡(jiǎn)單

該方法不需衍生，酶解后的樣品可直接進(jìn)樣，省時(shí)省力。

b) 高靈敏度檢測(cè)

脈沖安培檢測(cè)器（PAD）對(duì)糖類(lèi)物質(zhì)具有極高的靈敏度，無(wú)需復(fù)雜的樣品前處理或衍生化步驟，即可實(shí)現(xiàn)微量糖鏈的精準(zhǔn)檢測(cè)。

c) 高效分離

HPAEC-PAD利用陰離子交換色譜柱，能夠高效分離復(fù)雜糖鏈，即使是結(jié)構(gòu)相似的N-糖鏈也能清晰區(qū)分。

d) 定量分析能力強(qiáng)

HPAEC-PAD不僅可以定性分析N糖鏈的結(jié)構(gòu)，還能精確測(cè)定各糖鏈的相對(duì)含量，為EPO的質(zhì)量控制提供可靠數(shù)據(jù)。

e) 可與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用

HPAEC與高分辨制質(zhì)譜聯(lián)用，可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)N糖的結(jié)構(gòu)確證。

4. HPAEC-PAD用于唾液酸的含量測(cè)定                                                   

EPO的不均一性很大程度上是由糖鏈末端唾液酸化引起的，唾液酸化程度的高低直接影響著促紅素蛋白的體內(nèi)半衰期，與EPO的生物學(xué)體內(nèi)活性息息相關(guān)，是重要的質(zhì)控指標(biāo)。HPAEC-PAD對(duì)唾液酸同樣有良好的檢測(cè)能力。

圖4. 高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法測(cè)定EPO中的唾液酸含量（點(diǎn)擊查看大圖）

a) 與間苯二酚法相比【3】

優(yōu)勢(shì)：HPAEC-PAD法靈敏度和專屬性更高，可同時(shí)測(cè)定不同結(jié)構(gòu)操作簡(jiǎn)單。

局限：HPAEC-PAD法較間苯二酚法成本較高。

b) 與液相色譜法（HPLC）相比

優(yōu)勢(shì)：HPAEC-PAD測(cè)定唾液酸不需衍生，前處理更簡(jiǎn)單，節(jié)省時(shí)間和試劑，結(jié)果更準(zhǔn)確。

局限：離子色譜不及液相色譜普及。

5. 總結(jié)

EPO的N糖糖譜和唾液酸測(cè)定是確保其質(zhì)量、安全性和有效性的關(guān)鍵步驟，而HPAEC-PAD憑借其高分辨率、高靈敏度和強(qiáng)大的定量分析能力，成為這一領(lǐng)域最高效的技術(shù)。無(wú)論是科研還是生產(chǎn)，HPAEC-PAD都為EPO的N糖分析和唾液酸分析提供了可靠的技術(shù)支持。未來(lái)，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，HPAEC-PAD有望在更多生物制品的質(zhì)量控制中發(fā)揮更大作用！

參考文獻(xiàn)：

1. 李響,秦璽,裴德寧,等. 促紅素N-糖鏈的超高壓液相色譜分析方法驗(yàn)證[J]. 中國(guó)新藥雜志,2024,33(6):598-604.DOI:10.3969/j.issn.1003-3734.2024.06.012.

2. 李響,于雷,范文紅,等. 高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法用于重組人促紅素中唾液酸的含量測(cè)定[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2018,15(27):102-105.

3. 《中國(guó)藥典》2020年版

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