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使用基于適配子的抑制 DNA 聚合酶優(yōu)化 SNP 分析：成功 PCR 的關(guān)鍵技巧
什么是適配子？
適配子是短的單鏈寡核苷酸，旨在識(shí)別并結(jié)合特定的靶分子，例如蛋白質(zhì)或小分子。使用指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化 （SELEX） 過(guò)程，適配體的特異性和親和力進(jìn)行了優(yōu)化。
在 PCR 應(yīng)用中，適配體具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：
低分子量
易于修改
出色的穩(wěn)定性
基于適配子的 DNA 聚合酶抑制
在 Genaxxon，寡適配體用于特異性抑制 SNP DNA 聚合酶的活性。這些適配體在低溫下與聚合酶的活性位點(diǎn)結(jié)合，阻斷其活性。只有當(dāng)溫度超過(guò) 54°C 時(shí)，適配體才會(huì)分離，從而允許反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。
由于適配體在較高溫度下不會(huì)變性，因此當(dāng)溫度降至 54°C 以下時(shí)，它們會(huì)重新結(jié)合。這意味著，為了使用我們的 SNP DNA 聚合酶成功進(jìn)行 SNP 分析，退火溫度必須始終高于 55°C，以確保高效擴(kuò)增。 在引物設(shè)計(jì)過(guò)程中必須考慮這一點(diǎn)。
優(yōu)化退火 T溫度
如果退火溫度低于 55°C，則擴(kuò)增可能會(huì)顯著減少或抑制。對(duì)于富含 AT 的序列，應(yīng)使用較長(zhǎng)的引物以確保更強(qiáng)的結(jié)合。
提高退火溫度的另一種方法是使用鎖核酸 （LNA）。這些修飾的核酸于 1997 年由 Jesper Wengel （1） 和 Takeshi Imanishi （2） 獨(dú)立描述，此后成為基于雜交的應(yīng)用的主要成分。摻入單個(gè) LNA 堿基會(huì)使每個(gè) LNA 堿基引物的熔解或退火溫度升高約 2-3°C （3， 4）。對(duì)于 SNP 分析，LNA 堿基最好位于引物的中間，因?yàn)閷⑺鼈兎胖迷谀┒烁浇Ч^差。
結(jié)論
基于適配子的抑制劑在 SNP 分析中具有顯著優(yōu)勢(shì)，特別是在精確的聚合酶活性控制和高特異性方面。然而，最佳的 PCR 性能需要足夠高的退火溫度。如有必要，可以使用 LNA 寡核苷酸進(jìn)一步提高效率并獲得最佳結(jié)果。
Genaxxon 提供特殊適體抑制的 DNA 聚合酶，非常適合 SNP 分析。這些高選擇性酶經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)修飾，可用于精確的 PCR 檢測(cè)和突變檢測(cè)，非常適合“大海撈針”的用途。
Literatur
1. LNA (Locked Nucleic Acids): Synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine and uracil bicyclonucleoside monomers, oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition. Koshkin AA, Singh SK, Nielsen P, Rajwanshi VK, Kumar R, Meldgaard M, Olsen CE, Wengel J; Biochemistry (2006), 45 (23), S. 7447–7455; doi:10.1021/bi060307w.
2. Synthesis of 2′-O,4′-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3, -endo sugar puckering. Obika S, Nanbu D, Hari Y, Morio KI, In Y, Ishida T, Imanishi T; Tetrahedron Letters (1997), 38 (50), S. 8735–8738; doi:10.1016/S0040-4039(97)10322-7.
3. Structures, dynamics, and stabilities of fully modified locked nucleic acid (β-D-LNA and α-L-LNA) duplexes in comparison to pure DNA and RNA duplexes. Suresh G, Priyakumar UD; J Phys Chem B. (2013), 117(18):5556-64. doi: 10.1021/jp4016068.
4. Biological Activity and Biotechnological Aspects of Locked Nucleid Acids. Lundin KE, H?jland T, Hansen BR, Persson R, Bramsen JB, Kjems J, Koch T, Wengel J, Smith CI; Adv Genet. (2013), 82:47-107. doi: 10.1016/B978-0-12-407676-1.00002-0
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