免疫組化問題解答

1、染色過強

原因 解決方法
a 抗體濃度過高或孵育時間過長 降低抗體滴度、抗體孵育時間：室溫1小時或4度過夜
b 孵育溫度過高超過37度 一般在室溫20-28度
c DAB顯色時間過長或濃度過高 顯色時間不超過5-12分鐘，以顯微鏡下觀察為準

2、非特異性背景染色

原因 解決方法
a 操作過程中沖洗不充分 每步?jīng)_洗3次每次5分鐘
b 組織中含過氧化物酶未阻斷 可再配置新鮮3%H2O2封閉孵育時間延長
c 組織中含內(nèi)原性生物素 正常非免疫動物血清再封閉
d 血清蛋白封閉不充分 延長血清蛋白封閉時間

3、染色弱

原因 解決方法 
a 抗體濃度過低、孵育時間過短 提高抗體濃度、孵育時間不能少 于60分鐘
b 試劑超過有效使用時間 應(yīng)更換試劑
c 操作中添加試劑時緩沖液未瀝干 每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液
使試劑稀釋 （應(yīng)防止切片干燥）
d 室溫太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分鐘或4 度冰箱過夜
e 蛋白封閉過度 封閉不要超過12分鐘

4、染色陰性

原因 解決方法 
a 操作步驟錯誤 應(yīng)重試 設(shè)陽性對照
b 組織中無抗原 設(shè)陽性對照以驗證試驗結(jié)果
c 一抗與二抗種屬連接錯誤 仔細確定一抗二抗種屬無誤