百歐博偉生物：自然界中廣泛存在著各種微生物，這些微生物在食品生產(chǎn)各個環(huán)節(jié)中都可能會對食品造成污染。陶老師是微生物控制領(lǐng)域具有深厚影響力的學(xué)者，為了更加深入的了解微生物快速檢測方法，陶老師整理了關(guān)于食品中的微生物快速檢測的一些問題，并就這些問題一一作出了解答。

1、如何定義食品中微生物快速檢測方法？

食品快速檢測的廣泛定義是簡單、快速、準(zhǔn)確的分析方法，能夠?qū)μ幚砗玫臉悠吩诤芏痰臅r間內(nèi)檢測出結(jié)果。如今，大部分理化項(xiàng)目快速檢測方法可以實(shí)現(xiàn)在幾小時甚至幾分鐘內(nèi)檢測出結(jié)果。

快速檢測方法具有如下一個或者幾個特點(diǎn)：

（1）檢測時間比標(biāo)準(zhǔn)方法短；

（2）操作簡單，流程簡單，判斷明確；

（3）靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確；

（4）實(shí)現(xiàn)自動化。

但是，對于食品中微生物檢測而言，必須經(jīng)歷培養(yǎng)、增菌等階段，無法實(shí)現(xiàn)在1~2個小時內(nèi)出結(jié)果。

2、食品中微生物快速檢測方法具備的特點(diǎn)？

食品中微生物快速檢測方法具有如下一個或者幾個特點(diǎn)：

（1）操作簡便，檢測速度快，檢測時間短；

（2）靈敏度高、特異性強(qiáng)，檢測結(jié)果更為精確；

（3）自動化程度高，減少人為參與，降低人工成本；

（4）對檢驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)依賴程度低，操作簡單，易于標(biāo)準(zhǔn)化；

（5）產(chǎn)品更小、更輕、更便攜，更適合現(xiàn)場檢測。

3、目前常用的食品微生物快速檢測方法有哪些？

常用的食品微生物快速檢測技術(shù)從大類上主要有：傳統(tǒng)計(jì)數(shù)改良方法，免疫學(xué)方法，分子生物學(xué)方法。

（1）傳統(tǒng)計(jì)數(shù)改良方法是在傳統(tǒng)培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改良的計(jì)數(shù)方法，克服傳統(tǒng)方法培養(yǎng)時間長、操作繁瑣、誤差大等缺點(diǎn)，包括培養(yǎng)基改良法、濾膜法、紙片法。

（2）免疫方法是以抗原抗體的特異反應(yīng)為基礎(chǔ)，利用不同微生物特異抗原激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異抗體，從其特異性檢測相應(yīng)的致病微生物。常用的免疫學(xué)方法有酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)、上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)、免疫磁珠分離技術(shù)和乳膠凝集法等。

（3）分子生物學(xué)方法，其中PCR技術(shù)是應(yīng)用的分子生物學(xué)方法，主要應(yīng)用為普通PCR，熒光定量PCR和等溫?cái)U(kuò)增等。

除以上常見快檢方法外，近些年發(fā)展的飛行時間質(zhì)譜、微流控技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、新一代測序技術(shù)等新興技術(shù)也正在或?qū)⒁獞?yīng)用于食源性致病微生物的快速檢測。

4、幾種食品微生物快速檢測方法的差異主要有哪些？

改良的計(jì)數(shù)方法，克服傳統(tǒng)方法培養(yǎng)時間長、操作繁瑣、誤差大等缺點(diǎn)，操作接近國標(biāo)方法，目前使用泛，可定量，可定性。免疫學(xué)方法優(yōu)勢是特異性高，操作時間短、檢測結(jié)果可靠，適合批量檢測和自動化檢測（VIDAS），劣勢是高質(zhì)量抗體獲得困難、產(chǎn)品開發(fā)周期長、檢測靈敏度受靶標(biāo)蛋白的影響大。分子學(xué)方法優(yōu)勢是靶標(biāo)明確，操作時間短、檢測結(jié)果可靠，但核酸提取效率和系統(tǒng)穩(wěn)定性是一大挑戰(zhàn)。

5、如何評價一個食品微生物快速檢測體系？

食品中的微生物尤其是致病菌具有檢出率高但是含量低的特點(diǎn)，故檢測方法的靈敏度和之間有著很大的差異。因此，一個好的檢測系統(tǒng)應(yīng)該包括一個好的增菌培養(yǎng)方法和一個好的檢測方法，二者要綜合起來一起評價。一個好的增菌培養(yǎng)方法要滿足以下條件：微生物的復(fù)蘇能力要強(qiáng)，生長速度要快，選擇性要好，產(chǎn)量要高；而一個好的檢測方法需要具備速度快、準(zhǔn)確度高，結(jié)果準(zhǔn)確明晰等特點(diǎn)。

6、目前有國家標(biāo)準(zhǔn)的食品微生物快速檢測方法有哪些？

從GB 4789中可以看出，顯色培養(yǎng)基、微生物鑒定系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用，沙門氏菌、單增李斯特菌、阪崎腸桿菌、副溶血弧菌可采用全自動微生物檢測鑒定系統(tǒng)，除此之外，還有以下方法也被國標(biāo)應(yīng)用：

（1）GB 4789.6-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)中提到，取生化反應(yīng)符合大腸埃希氏菌特征的菌落進(jìn)行PCR確認(rèn)試驗(yàn)。

（2）GB 4789.10-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)中關(guān)于金葡腸毒素檢測，可用A、B、C、D、E型金黃色葡萄球菌腸毒素分型酶聯(lián)免疫吸附試劑盒完成。

（3）GB 4789.12-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn)肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)毒素基因檢測采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。

（4）GB 4789.36-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)，可用免疫磁珠捕獲法檢測，此外，毒力基因檢測采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。

（5）GB 4789.42-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn)諾如病毒檢驗(yàn)采用實(shí)時熒光RT－PCR方法進(jìn)行檢測。

（6）GB 14934-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)消毒餐（飲）具可采用餐具大腸菌群紙片法進(jìn)行檢測。  

7、國外微生物快速檢測方法的應(yīng)用情況如何？

目前，就技術(shù)應(yīng)用而言，歐盟使用傳統(tǒng)方法和快速方法的比例各占50%；美國主要以快速方法(包括基于免疫學(xué)技術(shù)的側(cè)向?qū)游鲈嚰埡虴LISA試劑盒)和分子生物學(xué)方法(如PCR)為主，我國仍沿用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，這已經(jīng)難以滿足食品安全監(jiān)管及企業(yè)/行業(yè)對檢驗(yàn)時效性的需求。   

8、目前大部分快速檢測方法沒有標(biāo)準(zhǔn)，企業(yè)可以用嗎？

國家標(biāo)準(zhǔn)方法是不可替代的，在產(chǎn)品出廠檢測、政府第三方出具報告等方面必須采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測。目前微生物的國標(biāo)檢測方法普遍為培養(yǎng)法，因此在談到微生物檢測的國標(biāo)時，通常指的是培養(yǎng)法，但是隨著技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的新技術(shù)及其方法將進(jìn)入國家標(biāo)準(zhǔn)。

在企業(yè)質(zhì)量內(nèi)控，如：原輔料檢測、生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)測、過程產(chǎn)品監(jiān)測等歡迎都可以采用快速檢測方法，但前提是，所選的方法／產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)室必須要跟國標(biāo)進(jìn)行比對，對準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性就行測試后方可采用。

9、企業(yè)如何選擇適合自己的微生物快速檢測方法？

沒有方法，只有的方法，企業(yè)在選擇快速檢測方法時要從產(chǎn)品、檢測項(xiàng)目、檢測量、預(yù)算等多個方面進(jìn)行考慮。選擇快速檢測產(chǎn)品時，要從產(chǎn)品的準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、操作便捷、成本等方面考慮。

（1）檢測樣品決定選用方法。檢測方法均具有一定的適用范圍，例如，諾如病毒的ELISA試劑盒適用范圍為糞便，如果制定為檢測蔬菜的行標(biāo)就不合適；在沙門氏菌檢驗(yàn)中低菌量樣品可以一步增菌。

（2）檢測項(xiàng)目決定選用方法。例如：定量檢測的項(xiàng)目，采用測試片、顯色培養(yǎng)基等方面；致瀉性大腸桿菌，采用PCR方法檢驗(yàn)；金葡腸毒素，采用免疫方法檢測。

（3）樣品數(shù)量。樣品數(shù)量大、建議采用免疫學(xué)方法,例如ELISA。

（4）實(shí)驗(yàn)室預(yù)算。預(yù)算少，可以采用不需要儀器紙片法、免疫學(xué)方法，預(yù)算多，可選用全自動微生物檢測鑒定儀、PCR等。

10、企業(yè)如何通過實(shí)驗(yàn)判定某個微生物快速檢測產(chǎn)品是否符合需求？

首先，判定標(biāo)準(zhǔn)要從準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、操作是否方便等方面進(jìn)行測試。其次，實(shí)驗(yàn)又分定量實(shí)驗(yàn)和定性試驗(yàn)兩種。定量實(shí)驗(yàn)，跟國標(biāo)方法比對準(zhǔn)確率和使用便捷性，設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)菌實(shí)驗(yàn)和樣品實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行計(jì)數(shù)比對，交叉反應(yīng)比對，判定生長率、特異性及穩(wěn)定性。定性試驗(yàn)，主要是致病菌檢測，比度假陽性／陰性率及使用便捷性，設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)菌實(shí)驗(yàn)和樣品添加實(shí)驗(yàn)，來判斷產(chǎn)品的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。此外，從驗(yàn)證頻率上，建議每半年進(jìn)行一次比對驗(yàn)證，確定產(chǎn)品的穩(wěn)定性；同時，建議同類產(chǎn)品選擇兩個以上品牌產(chǎn)品進(jìn)行使用。

11、熒光定量PCR、等溫PCR、普通PCR的區(qū)別？

實(shí)時熒光RT－PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)現(xiàn)實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，并對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。普通PCR是借助DNA電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析。等溫PCR又稱環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)能在等溫（60~65℃）條件下，短時間（通常是一小時內(nèi)）內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，是一種“簡便、快速、精確、低價”的基因擴(kuò)增方法（具體區(qū)別見表1）。

12、食品中致病菌快速檢測是否需要前增菌？是否必須增菌？

食品中致病菌檢測是否需要增菌要從檢測要求來看，定量檢測的如金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌等，可以均質(zhì)后直接進(jìn)行檢測。對于不得檢出的致病菌必須進(jìn)行增菌。國標(biāo)對食品檢測樣本的要求：1CFU/25g，25g樣品中不允許1CFU，樣品前處理后，1CFU/25g+ 225mL，培養(yǎng)基=0.004CFU/mL。再看幾種檢測方法的靈敏度：培養(yǎng)方法靈敏度均在103以上，免疫方法靈敏度均在105以上，PCR方法靈敏度也要求在102以上。食品樣本相對很干凈，不增菌，是無法到達(dá)檢測靈敏度的。

13、目前提高食品中致病菌增菌效率的方法有哪些？

增菌是檢測的前提，增菌效果如何，關(guān)系到靈敏度，對檢測至關(guān)重要。如國標(biāo)方法，沙門氏菌增菌需要至少兩天的時間，增菌時間長，主要是菌體的復(fù)蘇、生長和選擇性的問題。目前主要的增菌富集技術(shù)有：

（1）改良培養(yǎng)基成分和增菌方式，通過改良培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)溫度，讓菌體可以快速復(fù)式、生長，提高選擇性，可以在24小時之內(nèi)完成兩步增菌。

（2）免疫磁珠富集，磁珠上的抗體與相應(yīng)的目標(biāo)致病菌的抗原物質(zhì)結(jié)合后，則形成抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物，使復(fù)合物與其他物質(zhì)分離，而達(dá)到分離、濃縮、純化目標(biāo)致病菌的目的。

（3）噬菌體技術(shù)，利用噬菌體的專一性，通過噬菌體裂解殺死干擾菌，從而是目標(biāo)菌株實(shí)現(xiàn)快速的增殖。例如，在沙門氏菌的增菌過程中，通過噬菌體特異性的裂解干擾的大腸桿菌，從而實(shí)現(xiàn)沙門氏菌的快速、高濃度增殖。

（4）膜過濾和層析技術(shù)，過濾法富集微生物是將適當(dāng)孔徑的濾膜放入濾器，過濾樣品。由于濾膜的作用而將微生物滯留在膜表面，使微生物與樣品溶液分開，達(dá)到微生物富集目的。

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