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一直被模仿，從未被超越丨Agilent MHC 2D-LC/MS 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)介紹及其在生物制藥中的應(yīng)用案例分享
自 2014年 發(fā)布 MHC 2D-LC 系統(tǒng)（多中心切割），Agilent 一直在持續(xù)更新并完善 MHC 技術(shù)，旨在幫助科研工作者解決實際問題，提高工作效率。
2014 年，MHC 2D-LC 發(fā)布，可以一針進樣實現(xiàn)最多 11 個峰的智能存儲，并依次洗脫至二維進行檢測，提高效率，節(jié)約樣本；
2016 年，High Resolution Sampling（HiRes, 高頻采樣多中心切割）功能，實現(xiàn)對目標(biāo)峰的連續(xù) 10 片的智能存儲，可用于峰純度研究；
2017 年，Active Solvent Modulation （ASM，主動溶劑稀釋）閥發(fā)布，幫助解決一維組分的溶劑洗脫至二維時產(chǎn)生的溶劑效應(yīng)、鹽效應(yīng)和溶劑不互溶等問題，增加保留、改善峰型、提高質(zhì)譜響應(yīng)；
2017 年，MS Divert 閥發(fā)布，輕松將一維切割的組分中不揮發(fā)性鹽最大可能去除，有效降低不揮發(fā)性鹽帶來的質(zhì)譜信號抑制；
2021 年，Masshunter 實現(xiàn)對 MHC 2D-LC/MS 的數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理，并新增 Multi inject 實現(xiàn)富集效果，提高低含量雜質(zhì)的質(zhì)譜信號；
2022 年，BioMHC 2D-LC 發(fā)布，針對生物大分子分析的二維系統(tǒng)，可有效降低傳統(tǒng)不銹鋼系統(tǒng)對目標(biāo)組分的吸附或質(zhì)譜信號中存在的加合現(xiàn)象。
Agilent 特色 MHC 2D-LC
技術(shù)介紹
多中心切割（MHC）組件
獨特的 MHC 組件（圖 1）由三個閥頭組成，軟件控制閥頭之間聯(lián)動，實現(xiàn)一針進樣中最多實現(xiàn) 11 個目標(biāo)峰的智能存儲和洗脫。兩側(cè)閥頭各連接 6 個 loop，實現(xiàn)多個目標(biāo)峰的存儲，中間的閥頭為雙兩位四通閥，通過閥切換實現(xiàn) DeckA 或 B 和液相系統(tǒng)流路的連接。
圖 1. MHC 的連接示意圖及 Agilent 2D MHC/TOF 示意圖
獨特的 ASM 功能（圖 2），可有效的降低二維分離時由一維帶來的溶劑效應(yīng)或鹽效應(yīng)，特別是 Oligo，當(dāng)一維洗脫峰的鹽濃度過高時，其在二維的反相離子對系統(tǒng)上會因為保留差而導(dǎo)致質(zhì)譜信號降低，ASM 可以有效的解決上述問題；同時還可根據(jù)需要選擇不同的 ASM 的體積進而實現(xiàn)不同的分流比。
圖 2. ASM 管路為 1uL 的分流比 4:1
Masshunter 軟件
方法設(shè)置簡單，只需要將一維紫外譜圖導(dǎo)入（圖 3），點擊紫外譜圖下的目標(biāo)峰，軟件就能實現(xiàn)對目標(biāo)峰的智能存儲及洗脫；
圖 3. 點擊目標(biāo)峰即可輕松實現(xiàn)方法編輯（MHC 數(shù)據(jù)采集）
一鍵實現(xiàn)所有 cuts 除鹽及除鹽時間的設(shè)置（圖 4），設(shè)置除鹽時間可以保證質(zhì)譜信號的質(zhì)量，同時避免高鹽對質(zhì)譜的污染；
一鍵設(shè)置是否需要使用 ASM（圖 4），避免二維分離的溶劑效應(yīng)或鹽效應(yīng)；
圖 4. 方法中的智能的峰存儲及設(shè)置所有 cuts 的除鹽時間及 ASM 設(shè)置
圖 5. 數(shù)據(jù)采集時，系統(tǒng)流路狀態(tài)的實時顯示
實時顯示峰存儲及洗脫狀態(tài)（圖 5），清楚直觀的了解流路狀態(tài)；
可實現(xiàn)多種數(shù)據(jù)采集模式
MHC 采集（圖 3所示）：一針進樣，實現(xiàn)最多 11 個目標(biāo)峰的智能存儲和質(zhì)譜鑒定，節(jié)約樣本，提高效率;
HiRes 采集（圖 6 所示）：對目標(biāo)峰的連續(xù)切割（可連續(xù)存儲 10 片）實現(xiàn)對目標(biāo)峰純度的評估，如 Peptide 和 Oligo 的主峰純度研究；
圖 6. 對目標(biāo)峰的連續(xù)存儲的 HiRes 模式
HiRes Multi Inject 采集：在 HiRes 模式下，可將連續(xù)存儲的峰同時洗脫至二維進行分離檢測，實現(xiàn)低含量雜質(zhì)的目標(biāo)峰的質(zhì)譜鑒定；
MHC 和 HiRes 同時采集：在一針進樣中同時使用這兩種功能時，可在雜質(zhì)鑒定的同時實現(xiàn)對主峰的純度檢測。
Agilent MHC 2D-LC/6230 TOF
大分子表征的應(yīng)用案例——蛋白篇
MHC 應(yīng)用案例 1
蛋白離子交換酸性堿性峰質(zhì)譜鑒定
一維分離：Infinity II 1290 Bio 四元溶劑系統(tǒng)，配備 VWD 檢測器
離子交換，A 相：50mM PBS；B 相：50mM PBS，0.2M NaCl，梯度洗脫
二維分離：Infinity II 1290 二元超高效系統(tǒng)，反相分離，質(zhì)譜兼容的反相體系
質(zhì)譜采集：Agilent 6230 TOF
數(shù)據(jù)采集及處理軟件：Masshunter 及 BioConfirm12.1
實驗結(jié)果
1 針進樣，實現(xiàn)了對主峰和酸堿峰總共 5 個目標(biāo)峰的質(zhì)譜鑒定，通過解卷積結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸性峰 A1 和 A2 發(fā)生 Deamidation，堿性峰是由 K 的不完全切除導(dǎo)致（B1 和 B2 分別是 +K 和 +2K）。
圖 7. 應(yīng)用案例 1 分離譜圖及質(zhì)譜鑒定結(jié)果
MHC 應(yīng)用案例 2
蛋白離子交換酸性堿性峰質(zhì)譜鑒定
一維分離：Infinity II 1260 Bioinert 四元溶劑系統(tǒng)，配備 VWD 檢測器
離子交換，A 相：50mM 醋酸鈉（含吐溫 20）；B相：50mM 醋酸鈉（含吐溫 20），0.8MKCl，梯度洗脫
二維分離：Infinity II 1290 二元超高效系統(tǒng)，質(zhì)譜兼容的反相分離
質(zhì)譜：Agilent 6230 TOF
數(shù)據(jù)采集及處理：Masshunter 及 BioConfirm12.1
實驗結(jié)果
1 針進樣，并通過二維分離最大程度降低吐溫 20 對蛋白信號的干擾，實現(xiàn)對主峰和酸堿峰共 8 個目標(biāo)峰的質(zhì)譜鑒定，并發(fā)現(xiàn)酸性峰均發(fā)生序列截短，為后續(xù)的蛋白表達體統(tǒng)的優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支持。
圖 8. 應(yīng)用案例 2 分離譜圖及部分質(zhì)譜鑒定結(jié)果
MHC 應(yīng)用案例 3
ADC HIC分離不同DAR值的色譜峰鑒定，
實現(xiàn)ADC的DLD測定
一維分離：Infinity II 1260 Bioinert 四元溶劑系統(tǒng)，配備 VWD 檢測器
HIC分離，A 相：2M (NH4)2SO4 溶液，25mM 磷酸鹽；B 相：25mM 磷酸鹽，25% IPA
二維分離：Infinity II 1290 二元超高效系統(tǒng)，質(zhì)譜兼容的反相體系
質(zhì)譜：Agilent 6230 TOF
數(shù)據(jù)采集及處理軟件：Masshunter 及 BioConfirm12.1
實驗結(jié)果
進樣 2 針，實現(xiàn)對主峰 M 和小鋒 N 的 14 個峰的質(zhì)譜鑒定，確定主峰 DAR0（M1），DAR2（M2），DAR4（M3a 和 M3b），DAR6（M4）和 DAR8（M5）的偶聯(lián)類型，其中 DAR4 主要有 2 種偶聯(lián)類型，M3a 主要為輕鏈和重鏈鏈間的兩對二硫鍵全部偶聯(lián)藥物，M3b 主要為鉸鏈區(qū)兩對二硫鍵全部偶聯(lián)藥物。
圖 9. 應(yīng)用案例 3 分離譜圖及部分質(zhì)譜鑒定結(jié)果
這期主要介紹了 Agilent MHC 2D-LC/MS 系統(tǒng) 10 年多完善和創(chuàng)新，并使用 MHC 功能實現(xiàn)蛋白離子交換酸堿峰的質(zhì)譜鑒定和 HIC 分離 ADC 的 DLD 測定，下期我們將聚焦在 MHC HiRes 和 ASM 功能在 Peptide 和 Oligo 的應(yīng)用，敬請期待。
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