合理選擇凝膠濃度：依據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子量精準(zhǔn)匹配凝膠濃度是關(guān)鍵。當(dāng)分析小于 20kDa 的小分子蛋白質(zhì)時，12% - 15% 的高濃度凝膠能提供更細(xì)密的分子篩效應(yīng)，限制小分子蛋白質(zhì)的遷移，實現(xiàn)精細(xì)分離；而對于大于 100kDa 的大分子蛋白質(zhì)，7% - 10% 的低濃度凝膠更合適，較大的孔徑可確保大分子順利通過凝膠。若樣品蛋白質(zhì)分子量范圍跨度大，梯度凝膠（如 4% - 20%）能實現(xiàn)從低濃度到高濃度的過渡，使不同大小蛋白質(zhì)在凝膠的不同區(qū)域得到最佳分離 。

嚴(yán)格把控凝膠聚合：聚合過程中，溫度、催化劑用量都會影響凝膠質(zhì)量。將聚合溫度嚴(yán)格控制在 20 - 25℃，能保證凝膠孔徑均勻；精確添加過硫酸銨（APS）和四甲基乙二胺（TEMED），APS 作為引發(fā)劑，TEMED 加速聚合反應(yīng)，二者比例失調(diào)會導(dǎo)致凝膠聚合異常。同時，新鮮配制 APS 溶液，且 1 周內(nèi)使用，可保證其活性，避免因引發(fā)劑失效造成聚合、孔徑不均的問題。

精準(zhǔn)控制上樣量：上樣量過多會使蛋白質(zhì)在凝膠中過度堆積，導(dǎo)致條帶拖尾、重疊，嚴(yán)重影響分辨率。一般每孔總蛋白上樣量控制在 10 - 20μg，純化蛋白質(zhì)樣品 5 - 10μg 即可。使用校準(zhǔn)后的微量移液器，緩慢且精準(zhǔn)地吸取和添加樣品，防止樣品溢出污染相鄰泳道，同時保證各泳道上樣量一致，避免因上樣差異干擾分辨率。

優(yōu)化樣品變性處理：樣品與上樣緩沖液混合后，煮沸時間需精準(zhǔn)控制。通常 5 - 10 分鐘為宜，時間過短蛋白質(zhì)無法充分變性，影響其在凝膠中的遷移；時間過長，部分蛋白質(zhì)可能發(fā)生聚集，形成大分子復(fù)合物，改變遷移特性。對于含大量二硫鍵的蛋白質(zhì)，可適當(dāng)延長煮沸時間至 10 分鐘，確保二硫鍵充分?jǐn)嗔?，使蛋白質(zhì)伸展為線性分子。

優(yōu)化電泳緩沖液：Tris - 甘氨酸緩沖液是常用選擇，但要確保其 pH 穩(wěn)定在 8.3 左右，pH 波動會改變蛋白質(zhì)所帶電荷，影響遷移速度和分離效果。定期更換電泳緩沖液，隨著電泳進(jìn)行，緩沖液中離子不斷消耗，離子強(qiáng)度改變會影響電場穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)遷移，一般連續(xù)使用 2 - 3 次后更換新緩沖液。對于對分辨率要求高的小分子蛋白質(zhì)分離，可嘗試 MOPS 或 MES 緩沖系統(tǒng)，它們能提供更穩(wěn)定的 pH 環(huán)境和更好的分離效果。

調(diào)整電泳電壓與時間：降低電泳電壓并適當(dāng)延長電泳時間，可使蛋白質(zhì)在凝膠中遷移更充分，減少擴(kuò)散，獲得更清晰條帶。例如，將電壓從 200V 降至 100V，雖然電泳時間延長，但蛋白質(zhì)有更充足時間依據(jù)分子量差異進(jìn)行分離，分辨率顯著提高。同時，采用分步電壓策略，開始用較低電壓（如 80V）使蛋白質(zhì)在凝膠中均勻分布，再逐步升高電壓（如 120V）加快分離進(jìn)程，也是提升分辨率的有效方法。

運(yùn)用梯度凝膠電泳：梯度凝膠的孔徑沿凝膠長度方向逐漸變化，蛋白質(zhì)在遷移過程中，隨著孔徑變小，不同分子量蛋白質(zhì)在合適孔徑處停止遷移，實現(xiàn)更精細(xì)分離。相較于均一濃度凝膠，梯度凝膠能在同一凝膠上分離更寬分子量范圍的蛋白質(zhì)，且條帶更銳利、分辨率更高，尤其適合復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物分析。

選擇高質(zhì)量預(yù)制膠與設(shè)備：高質(zhì)量預(yù)制膠經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)量控制，凝膠濃度均一、聚合條件穩(wěn)定，能減少因手工制膠誤差導(dǎo)致的分辨率降低問題。同時，確保電泳槽干凈無污染，殘留的 SDS、蛋白質(zhì)會干擾電場分布和蛋白質(zhì)遷移；使用精準(zhǔn)控溫、穩(wěn)定電場的電泳儀，為蛋白質(zhì)分離提供穩(wěn)定環(huán)境，也是提高分辨率的重要保障。