來源：瑞孚迪生命科學(xué)

作者：王多魚

單細(xì)胞測(cè)序

單細(xì)胞測(cè)序是指在單個(gè)細(xì)胞水平上，對(duì)基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組等遺傳信息進(jìn)行高通量測(cè)序分析的一項(xiàng)技術(shù)。它能夠揭示單個(gè)細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)，反映細(xì)胞間的異質(zhì)性，在腫瘤、發(fā)育生物學(xué)、微生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，正成為生命科學(xué)研究的焦點(diǎn)。與傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)相比，單細(xì)胞測(cè)序不僅測(cè)量基因表達(dá)水平更加精確，而且還能檢測(cè)到微量的基因表達(dá)子或罕見非編碼RNA，其優(yōu)勢(shì)是多層次的。

如何實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞測(cè)序
單細(xì)胞測(cè)序流程包括：?jiǎn)渭?xì)胞的分離制備、遺傳物質(zhì)的提取擴(kuò)增以及遺傳物質(zhì)的高通量測(cè)序。(圖1)

圖1.單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組流程

細(xì)胞計(jì)數(shù)儀在單細(xì)胞測(cè)序中的應(yīng)用
在整個(gè)流程中高質(zhì)量的單細(xì)胞（核）懸液是實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)，無論起始樣本如何，良好的細(xì)胞（核）狀態(tài)對(duì)于有效的細(xì)胞捕獲和后續(xù)進(jìn)一步研究都至關(guān)重要。大多數(shù)情況下，研究者會(huì)選用新鮮離體的樣本制備成單細(xì)胞懸液，但是有些樣本并不適用，需要進(jìn)行細(xì)胞核抽提制備成細(xì)胞核懸液。（例如心臟、肌肉、脂肪等樣本由于細(xì)胞直徑過大，無法被機(jī)器捕獲。由于有些細(xì)胞相對(duì)脆弱，單細(xì)胞懸液制備過程中會(huì)破裂影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比如肝臟細(xì)胞。神經(jīng)細(xì)胞比較敏感，樣本消化過程中會(huì)改變某些基因的表達(dá)等。）兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，根據(jù)具體樣本和實(shí)驗(yàn)選擇。

對(duì)于得到的單細(xì)胞或細(xì)胞核樣本需要進(jìn)行質(zhì)控來確保樣本的質(zhì)量，以10xGenomics單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)為例，對(duì)于單細(xì)胞懸液要求：細(xì)胞總量>5x105cells、細(xì)胞濃度1x103cells/μl、細(xì)胞直徑5-30μm、細(xì)胞活率>70%、無細(xì)胞碎片或其他顆粒物，對(duì)于單細(xì)胞核懸液要求：細(xì)胞活性<5%、盡量無碎片和細(xì)胞團(tuán)、細(xì)胞核形態(tài)完整。由于單細(xì)胞測(cè)序樣本制備后需要在較短的時(shí)間內(nèi)完成后續(xù)遺傳物質(zhì)提取，所以需要進(jìn)行快速準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)。對(duì)于這些質(zhì)控需求我們通過Cellometer系列細(xì)胞計(jì)數(shù)儀即可完成。目前市場(chǎng)上的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀主要有兩種計(jì)數(shù)方法：基于臺(tái)盼藍(lán)染色的明場(chǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和基于AO/PI/DAPI的熒光計(jì)數(shù)方法，經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，臺(tái)盼藍(lán)染色有兩個(gè)問題。首先，原代細(xì)胞樣品中含有紅細(xì)胞、血小板和細(xì)胞碎片，在未經(jīng)純化的樣本中會(huì)嚴(yán)重的影響計(jì)數(shù)結(jié)果（圖2a），其次，臺(tái)盼藍(lán)染色會(huì)影響不健康的細(xì)胞和死亡的細(xì)胞，從而低估死亡細(xì)胞的數(shù)量和活力（圖2b）。

圖2.使用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行明場(chǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)。（左）樣品中有大量非特異性顆粒，難以將PBMC與紅細(xì)胞和血小板進(jìn)行區(qū)分。（右）臺(tái)盼藍(lán)影響死細(xì)胞的形態(tài)，形成深色的擴(kuò)撒輪廓。

Cellometer系列細(xì)胞計(jì)數(shù)儀不僅支持臺(tái)盼藍(lán)染色方法，同時(shí)支持AO/PI染色方法，采用吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）雙熒光混合染料，分別對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行染色并自動(dòng)計(jì)數(shù)，可以有效避免臺(tái)盼藍(lán)染色方法中的問題。在單細(xì)測(cè)序中，大部分都是原代細(xì)胞樣品或者需要進(jìn)行細(xì)胞核抽提的樣本，需要對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色并計(jì)數(shù)來確定樣品制備情況。Cellometer系列細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可以通過AO/PI染色對(duì)原代或者脆弱的細(xì)胞樣本（如全血、PBMCs、肝細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞等）中的有核細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)的識(shí)別計(jì)數(shù)，其中非有核物體（如紅細(xì)胞、血小板或碎片等）被排除在外。（圖3）

圖3. 不同種類細(xì)胞計(jì)數(shù)

細(xì)胞的形態(tài)多種多樣，大小各不相同，因此對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)來說，能夠識(shí)別和分割不同的細(xì)胞類型和形態(tài)至關(guān)重要。Cellometer軟件具有的勾勒細(xì)胞輪廓的精確算法，精準(zhǔn)識(shí)別和計(jì)數(shù)直徑從3-300μm的細(xì)胞。對(duì)于單細(xì)胞測(cè)序，為了防止微流控裝置堵塞，需要將上機(jī)樣品制備成單細(xì)胞懸液，不能有細(xì)胞團(tuán)塊。Cellometer軟件可以確定單細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量，以確保細(xì)胞樣品可以進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。（圖4）

圖4.單細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊計(jì)數(shù)

Cellometer軟件中內(nèi)置了幾百種默認(rèn)細(xì)胞庫(kù)，滿足大部分細(xì)胞計(jì)數(shù)要求，同時(shí)對(duì)于特定的細(xì)胞類型和計(jì)數(shù)要求，軟件中具有多種參數(shù)可以定制化調(diào)節(jié)。在單細(xì)胞測(cè)序中，單細(xì)胞核懸液中的細(xì)胞核的數(shù)量可以通過PI染色進(jìn)行定量。（圖5）另外Cellometer K2細(xì)胞計(jì)數(shù)儀支持GMP/GLP或21CFR，為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提供安全保證。

圖5.單細(xì)胞核計(jì)數(shù)

Cellometer K2配有Matrix圖像識(shí)別軟件，利用明場(chǎng)和雙熒光成像，可快速準(zhǔn)確地識(shí)別單個(gè)細(xì)胞并計(jì)數(shù)。軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算和顯示細(xì)胞數(shù)、濃度、直徑和存活率%。

Cellometer K2具有以下優(yōu)點(diǎn)：

雙熒光和明場(chǎng)成像 – 只對(duì)有核細(xì)胞進(jìn)行染色，可獲得最準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活率%

快速獲得結(jié)果 – 60秒內(nèi)即可完成對(duì)細(xì)胞數(shù)、大小和濃度以及存活率%的計(jì)算

分析復(fù)雜樣本 – 可分析多種復(fù)雜樣本，包括全血、外周血、臍帶血、骨髓等

多視野 – 準(zhǔn)確度更高，針對(duì)每個(gè)樣本，可捕獲一個(gè)、四個(gè)或八個(gè)圖像

預(yù)設(shè)實(shí)驗(yàn) – 可快速分析細(xì)胞存活率%、細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)染效率

預(yù)設(shè)細(xì)胞類型 – 已保存的參數(shù)涵蓋400多種細(xì)胞類型

樣本體積小 – 僅需10μl的細(xì)胞樣本

可自定義報(bào)告 – 可以根據(jù)需求設(shè)計(jì)報(bào)告內(nèi)容，包括創(chuàng)建曲線圖、圖片、圖表和表格等內(nèi)容

支持多種語(yǔ)言 – 支持7000多種語(yǔ)言

符合21 CFR Part 11要求 – 多種附加功能可供選擇，包括審計(jì)追蹤、用戶分級(jí)管理、電子簽名