??1. 工作原理??

冷凍聚焦離子束顯微鏡（??Cryo-FIB??）是一種結(jié)合 ??聚焦離子束（FIB）加工?? 和 ??冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）樣品制備?? 的技術(shù)，主要用于對 ??冷凍生物樣品?? 或 ??敏感材料?? 進行納米級精密切削和成像。其核心工作原理如下：

??（1）冷凍樣品制備??

• 樣品通過 ??快速冷凍（如液氮冷卻）?? 形成玻璃態(tài)冰（Vitreous Ice），避免冰晶損傷。
• 冷凍樣品轉(zhuǎn)移至 ??Cryo-FIB?? 系統(tǒng)，保持 ??低溫（約 -140°C 至 -180°C）??，防止水蒸發(fā)或結(jié)構(gòu)破壞。

??（2）聚焦離子束（FIB）加工??

• ??離子源（Ga? 或 He?/Ne?）?? 發(fā)射高能離子束（典型能量 ??30 keV??）。
• 離子束聚焦至 ??納米級束斑（5–10 nm）??，轟擊樣品表面，通過 ??濺射效應(yīng)?? 去除材料。
• ??精確控制離子束掃描??，實現(xiàn) ??薄片制備（<200 nm）?? 或 ??表面刻蝕??，用于后續(xù)冷凍電鏡（Cryo-EM）或冷凍電子斷層掃描（Cryo-ET）觀察。

??（3）電子束成像（可選）??

• 部分 ??Cryo-FIB/SEM?? 系統(tǒng)集成 ??掃描電子顯微鏡（SEM）??，可在加工過程中實時觀察樣品形貌（低劑量成像）。

??2. 系統(tǒng)構(gòu)成??

Cryo-FIB 系統(tǒng)主要由以下關(guān)鍵模塊組成：

??（1）冷凍樣品傳輸與保持系統(tǒng)??

• ??冷凍樣品臺（Cryo-stage）??：保持樣品在 ??-140°C 至 -180°C?? 低溫環(huán)境。
• ??防污染冷阱（Anti-contamination Cold Trap）??：減少水汽凝結(jié)，避免樣品污染。
• ??冷凍傳輸裝置??：將樣品從冷凍制備設(shè)備（如 plunge freezer）安全轉(zhuǎn)移至 FIB 腔室。

??（2）離子束系統(tǒng)??

• ??離子源??：常用 ??鎵離子（Ga?）??，系統(tǒng)可選 ??氦離子（He?）?? 或 ??氖離子（Ne?）??，提供更高分辨率加工。
• ??離子光學(xué)系統(tǒng)??：靜電透鏡和偏轉(zhuǎn)線圈控制離子束聚焦與掃描。
• ??束斑控制??：可實現(xiàn) ??5–100 nm?? 束斑調(diào)節(jié)，適應(yīng)不同加工需求。

??（3）電子束成像系統(tǒng)（可選）??

• ??掃描電子顯微鏡（SEM）模塊??：低電壓（1–5 keV）電子束成像，減少樣品損傷。
• ??二次電子（SE）或背散射電子（BSE）探測器??：用于加工過程的實時監(jiān)控。

??（4）氣體注入系統(tǒng)（GIS）??

• ??沉積氣體（如 Pt、C）??：用于 ??保護層沉積?? 或 ??修復(fù)損傷區(qū)域??。
• ??刻蝕氣體（如 XeF?）??：增強特定材料的離子束刻蝕效率。

??（5）控制系統(tǒng)與軟件??

• ??自動化切片軟件??：預(yù)設(shè)加工路徑，實現(xiàn) ??自動薄片制備??（如 AutoSlice & View）。
• ??低劑量成像模式??：減少電子束對敏感樣品的輻照損傷。

??3. 技術(shù)優(yōu)勢與挑戰(zhàn)??

??（1）優(yōu)勢??

• ??保持樣品天然狀態(tài)??：冷凍環(huán)境避免水蒸發(fā)和結(jié)構(gòu)塌陷，適用于 ??生物大分子、細胞、軟材料??。
• ??高精度加工??：納米級定位切削，制備 ??Cryo-EM 所需超薄樣品（<200 nm）??。
• ??多模態(tài)聯(lián)用??：結(jié)合 ??Cryo-SEM、Cryo-ET??，實現(xiàn)從加工到高分辨成像的全流程分析。

??（2）挑戰(zhàn)??

• ??冰污染風(fēng)險??：樣品轉(zhuǎn)移過程中可能形成非晶冰，影響成像質(zhì)量。
• ??離子束損傷??：高能離子轟擊可能導(dǎo)致樣品非晶化或成分改變（需優(yōu)化束流參數(shù)）。
• ??設(shè)備復(fù)雜度??：需嚴(yán)格維持低溫、高真空環(huán)境，操作與維護成本高。

??4. 典型應(yīng)用??

• ??結(jié)構(gòu)生物學(xué)??：制備 ??冷凍電鏡（Cryo-EM）?? 樣品，解析蛋白質(zhì)復(fù)合體或病毒結(jié)構(gòu)。
• ??材料科學(xué)??：加工 ??鋰金屬負(fù)極、水凝膠?? 等敏感材料，研究界面或缺陷結(jié)構(gòu)。
• ??細胞生物學(xué)??：對冷凍細胞進行 ??原位截面制備??，用于冷凍電子斷層掃描（Cryo-ET）。

??5. 未來發(fā)展方向??

• ??更低損傷離子源??：如 ??氦離子（He?）?? 替代 Ga?，減少樣品損傷。
• ??AI 輔助自動化??：智能識別感興趣區(qū)域（ROI），優(yōu)化加工路徑。
• ??多束聯(lián)用平臺??：集成 ??離子束、電子束、X射線??，實現(xiàn)多維數(shù)據(jù)采集。

??6. 總結(jié)??

冷凍聚焦離子束顯微鏡（Cryo-FIB）通過 ??低溫離子束加工??，解決了傳統(tǒng) FIB 對生物和敏感材料的損傷問題，成為 ??冷凍電鏡樣品制備?? 和 ??納米材料研究?? 的關(guān)鍵工具。其技術(shù)核心在于 ??低溫環(huán)境控制、高精度離子束切削?? 和 ??多模態(tài)聯(lián)用能力??，未來將進一步向 ??低損傷、智能化、高通量?? 方向發(fā)展。