標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

上海滬峰是由留學(xué)美國多年的資深學(xué)者創(chuàng)辦的一家*企業(yè)，與中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、哈爾濱獸醫(yī)研究所等多家高校及生物技術(shù)研究機(jī)構(gòu)建立了合作關(guān)系。公司以開發(fā)的動(dòng)物疾病診斷試劑、食品安全檢測(cè)試劑、人體疾病診斷試劑、環(huán)境監(jiān)測(cè)試劑、新型酶制劑、微生物制劑、蛋白質(zhì)產(chǎn)品、核苷酸產(chǎn)品、綠色水產(chǎn)藥品、小分子抗原抗體、基因重組抗原抗體等生物化學(xué)制品為主，以*的化企業(yè)經(jīng)營理念、雄厚的研發(fā)實(shí)力、規(guī)范化的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)、健全的銷售網(wǎng)絡(luò)、完善的技術(shù)服務(wù)體系和廣闊的國內(nèi)外合作網(wǎng)絡(luò)服務(wù)于，致力于生物制劑在的產(chǎn)業(yè)化。

1. 定量定義 定量是用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知樣品的量。 將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同濃度，作為模板進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為 橫坐標(biāo)，以測(cè)得的 CT 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)未知樣品進(jìn)行定量時(shí)，根據(jù)未知樣品 的 CT 值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。 * Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系， 通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線， 即得 到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系 * 由樣品 CT 值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量
2. 定量標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品的一些標(biāo)準(zhǔn) * 必須用與擴(kuò)增目的基因相同的引物進(jìn)行擴(kuò)增，并且擴(kuò)增效率相同 * 標(biāo)準(zhǔn)品必須是經(jīng)過準(zhǔn)確定量的（我們通常用的是 ASP-3700 紫外光/可見光微量分光光度 計(jì)） * 標(biāo)準(zhǔn)品必須是標(biāo)準(zhǔn)化的（例如，同一化的細(xì)胞數(shù)） * 在每組實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須用相同的閾值設(shè)定來確定 CT 值 標(biāo)準(zhǔn)品可以是含有目的基因的線性化的質(zhì)粒 DNA，也可以是比擴(kuò)增片段長(zhǎng)的純化 后的 PCR 產(chǎn)物，當(dāng)然也可以是基因組 DNA，甚至 cDNA，但前提是所有的作為標(biāo)準(zhǔn)品的核 酸都必須保證穩(wěn)定。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品的制備
一般一條標(biāo)準(zhǔn)曲線取四到五個(gè)點(diǎn)， 濃度范圍要能覆蓋樣品的濃度區(qū)間， 以保證定量的準(zhǔn)確性。 一般一個(gè)點(diǎn)重復(fù)三至五次， 對(duì)于常期穩(wěn)定使用的標(biāo)準(zhǔn)品可以適當(dāng)減少重復(fù)的次數(shù)。

倍比梯度稀釋方法： 1v 原液（標(biāo)準(zhǔn)品 i）+9v 稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品 ii 1v 標(biāo)準(zhǔn)品 ii+9v 稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品 iii 1v 標(biāo)準(zhǔn)品 iii+9v 稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品 iv 1v 標(biāo)準(zhǔn)品 iv+9v 稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品 v 依次倍比稀釋 拷貝數(shù)的計(jì)算：詳見核酸拷貝數(shù)的計(jì)算 4. 實(shí)例 標(biāo)準(zhǔn)品的制作：將標(biāo)準(zhǔn)品依次進(jìn)行 10 倍稀釋，ASP-3700 測(cè)得其拷貝數(shù) 1.55×108copy /ul 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1cycle=1min） 設(shè)置對(duì)照：濃度為 1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104、1.55×103、1.55×102、 1.55×101 的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè)，設(shè)空白對(duì)照 PCR 反應(yīng)：以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品作為模板