番茄內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)Apx基因探針法qPCR試劑盒實(shí)驗(yàn)操作步驟

在完成反應(yīng)體系配制后，將PCR管或96孔板短暫離心，確保液體集中于管底，避免氣泡干擾。隨后將反應(yīng)板置于qPCR儀中，按照以下程序設(shè)置擴(kuò)增條件：

1. 預(yù)變性階段：95℃維持30秒，充分激活DNA聚合酶并打開模板二級(jí)結(jié)構(gòu)；

2. 循環(huán)擴(kuò)增階段：95℃變性5秒，60℃退火/延伸30秒（根據(jù)引物Tm值可微調(diào)），重復(fù)40個(gè)循環(huán)；

3. 熔解曲線分析（可選）：從60℃緩慢升溫至95℃，每0.5℃采集一次熒光信號(hào)，驗(yàn)證擴(kuò)增特異性。

實(shí)驗(yàn)過程中需注意：

- 陰性對(duì)照：設(shè)置無模板對(duì)照（NTC）以排除污染風(fēng)險(xiǎn)；

- 重復(fù)孔：每個(gè)樣本至少設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)，確保數(shù)據(jù)可靠性；

- 熒光通道選擇：若使用探針法，需匹配儀器FAM/HEX等通道，避免信號(hào)串?dāng)_。

數(shù)據(jù)分析時(shí)，采用ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量。首先用內(nèi)參基因（如Actin）Ct值校正樣本間差異，再通過實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的Ct差值比較獲得表達(dá)倍數(shù)變化。若熔解曲線出現(xiàn)多峰或陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增，需排查引物二聚體或污染問題。

為提高實(shí)驗(yàn)成功率，建議在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化退火溫度及引物濃度。此外，試劑盒開封后需分裝保存，避免反復(fù)凍融影響酶活性。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牟僮髁鞒毯唾|(zhì)控步驟，可確保番茄Apx基因表達(dá)分析的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。