Q1：什么是標記定量蛋白質組學？

A1：標記定量蛋白質組學是通過化學或同位素標簽對蛋白質或肽段進行標記，從而在質譜分析中區(qū)分不同樣本，實現(xiàn)相對或絕對定量的技術。常見方法包括iTRAQ、TMT和SILAC 。

Q2：基于SILAC、iTRAQ/TMT 的蛋白定量有什么區(qū)別？

A2：

SILAC：是一種在細胞培養(yǎng)過程中使用的代謝標記方法，通常支持 2-3 重（使用 NeuCode 最多可支持 4 重以上）。定量在一級質譜 (MS1) 水平進行。

iTRAQ：是一種化學同位素標記方法，支持 4-8 重。定量在二級質譜 (MS2) 水平進行。

TMT：也是一種同位素化學標記技術，支持 10-18 重，適用于大規(guī)模、高通量研究。定量在二級質譜 (MS2) 水平進行。

Q3：與非標記方法相比，基于標記的定量蛋白質組學有哪些優(yōu)勢？

A3：基于標記的蛋白質組學由于所有樣品同時混合和分析，因此定量準確度更高，樣品間的重現(xiàn)性也更好。它還能減少因單獨運行而造成的技術差異，并支持多重分析，允許在單次質譜分析中比較多個樣品。

Q4：如何選擇合適的標記定量方法？

A4：這取決于您的樣本類型、實驗規(guī)模和研究目標。

1、如果您使用的是活細胞，并且需要在細胞水平上進行精確定量，請使用 SILAC。該方法非常適合動態(tài)研究，例如時間進程實驗或治療反應，因為標記發(fā)生在細胞生長過程中。

2、iTRAQ 適用于組織或體液樣本，可為中等通量研究提供良好的靈敏度和可重復性。

3、TMT 也適用于組織和體液樣本，是高通量研究的shǒu xuǎn，每次運行最多可進行 18 個樣本的多重分析。

還需要考慮儀器兼容性、所需的多重分析水平和預算等因素。

Q5：iTRAQ/TMT定量中為何采用 MS2 而不是 MS1 進行 reporter 離子定量？

A5：在iTRAQ和TMT實驗中，所有標記肽段都是同量異位素的——它們在MS1水平上具有相同的質量數(shù)，并且在色譜分析過程中會共流出。因此，在MS1掃描中無法區(qū)分它們。在MS2碎裂后，每個標記肽段都會釋放出具有不同m/z的dú tè報告離子，因此可以根據(jù)這些報告離子的強度對每個樣品進行精確定量。

Q6：標記定量能否用于絕對定量？

A6：是的，基于標記的定量蛋白質組學可以用于絕對定量，但需要使用已知濃度的標準肽段或蛋白質進行校準。在該方法中，通過加入已知濃度的合成肽段或蛋白質來生成標準曲線。通過將報告離子的強度（在 iTRAQ/TMT 中）或 MS1 峰強度（在 SILAC 中）與標準曲線進行比較，研究人員可以計算出樣品中目標蛋白的絕對濃度。然而，這種方法比相對定量更復雜，因為它涉及額外的校準步驟，通常用于需要精確定量蛋白質含量的情況。

Q7：哪些樣本可以在同一批TMT或iTRAQ實驗中混合分析？

A7：建議將來源一致、處理條件明確且具有可比性的樣本安排在同一TMT或iTRAQ批次中，例如同種細胞或組織在“對照 vs 藥物處理”條件下的比較。不同組織（如肝臟、腦組織、肌肉等）蛋白組成和復雜度差異顯著，混合標記可能導致高豐度蛋白掩蓋低豐度信號，降低鑒定通量和定量準確性。此外，應避免將不同批次采集或處理的樣本放入同一標記組，以減少技術誤差干擾。總之，TMT/iTRAQ實驗應最大限度保持樣本在生物背景和實驗條件上的一致性，以確保數(shù)據(jù)的科學性和可比性。

Q8：不同組織間TMT信號偏移是否可以通過數(shù)據(jù)歸一化處理解決？

A8：部分偏差可以通過總強度歸一化、中位數(shù)校正等方法進行技術層面的調整，但如果生物本底差異過大，歸一化往往會掩蓋真實差異或放大假陽性。因此，數(shù)據(jù)預處理不能替代科學的實驗分組。

Q9：利用SILAC穩(wěn)定同位素標記細胞后，多長時間可以提取細胞蛋白進行后續(xù)質譜鑒定？

A9：SILAC為體內標記，其隨著細胞增殖對蛋白進行標記，通常需要連續(xù)傳代至少5–6代（population doublings），確保細胞內的天然氨基酸（如Lys、Arg）被同位素標記的氨基酸wán quán替代。具體時間因細胞類型而異。標記是否wán quán，可以通過質譜預實驗檢測標記效率，標記率需 ≥95% 才適合進行正式的SILAC質譜分析。

Q10：TMT實驗中，如何評估樣本之間的混合是否均一？

A10：可在標記前后分別取少量樣本進行SDS-PAGE定量比對，標記后也可在MS中查看各reporter離子強度是否大致均衡，若偏差大需重新標記或混合。

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