一、細(xì)胞特性與應(yīng)用價(jià)值

永生化人牙周膜成纖維細(xì)胞 - SV40 是一種經(jīng)過(guò)特殊處理的細(xì)胞系，其通過(guò)將 SV40 大 T 抗原導(dǎo)入人牙周膜成纖維細(xì)胞而獲得永生化特性。這種細(xì)胞系保留了正常人牙周膜成纖維細(xì)胞的部分生物學(xué)特性，同時(shí)具備無(wú)限增殖的能力，為牙周組織相關(guān)的研究提供了穩(wěn)定的細(xì)胞模型。

在牙周組織工程領(lǐng)域，它們可用于研究牙周組織的再生機(jī)制，例如探索不同生物材料與成纖維細(xì)胞相互作用對(duì)牙周組織修復(fù)的影響。在藥物篩選方面，可用于測(cè)試新型藥物對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞生理功能（如增殖、遷移、分化等）的作用，從而為牙周疾病治療藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。另外，對(duì)于研究牙周膜成纖維細(xì)胞在牙周炎等疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的細(xì)胞學(xué)變化和分子機(jī)制，該細(xì)胞系也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

二、細(xì)胞培養(yǎng)前的準(zhǔn)備工作

（一）培養(yǎng)設(shè)備與器材檢查

在開始細(xì)胞培養(yǎng)之前，需要對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)所需的設(shè)備和器材進(jìn)行全面的檢查。細(xì)胞培養(yǎng)箱是維持細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的關(guān)鍵設(shè)備，應(yīng)確保其溫度、濕度和 CO?濃度的控制精準(zhǔn)且穩(wěn)定。一般設(shè)定溫度為 37℃，濕度保持在 95% 左右，CO?濃度為 5%。檢查培養(yǎng)箱的水盤是否有足夠的水，以維持濕度；同時(shí)觀察培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度和 CO?濃度是否在設(shè)定范圍內(nèi)，如有偏差及時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。

顯微鏡是觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)的重要工具，需檢查其目鏡和物鏡是否清潔，調(diào)節(jié)焦距的功能是否正常，以確保能夠清晰準(zhǔn)確地觀察細(xì)胞的各種細(xì)節(jié)，如細(xì)胞的形態(tài)、大小、細(xì)胞核的狀態(tài)以及是否有污染等情況。

培養(yǎng)皿、離心管等耗材的質(zhì)量也會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果。檢查培養(yǎng)皿的表面是否光滑、平整，有無(wú)劃痕、裂紋等缺陷；離心管是否密封良好，有無(wú)破損。使用前，所有耗材都應(yīng)按照要求進(jìn)行滅菌處理，一般采用高壓滅菌（121℃，15 - 20 分鐘）或使用無(wú)菌包裝的一次性耗材，以避免細(xì)菌、真菌等微生物污染細(xì)胞。

（二）培養(yǎng)基配制與滅菌

永生化人牙周膜成纖維細(xì)胞 - SV40 的培養(yǎng)基通常由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和多種添加成分組成。常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）或 Minimum Essential Medium（MEM）。這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基提供了細(xì)胞生長(zhǎng)所需的基本營(yíng)養(yǎng)成分，包括碳水化合物、氨基酸、維生素等。

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，需要添加適量的胎牛血清（FBS），一般添加比例為 10% - 15%。胎牛血清富含多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子、激素、黏附因子等，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，同時(shí)為細(xì)胞提供一個(gè)類似于體內(nèi)環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)支持。此外，還需要加入青霉素 - 鏈霉素溶液（通常濃度為 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素），以防止細(xì)菌和真菌的污染。部分實(shí)驗(yàn)室還會(huì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求添加其他成分，如胰島素、表皮生長(zhǎng)因子等，以優(yōu)化細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境。

配制好的培養(yǎng)基需要進(jìn)行滅菌處理，一般采用高壓蒸汽滅菌法。將培養(yǎng)基分裝到合適的容器中，設(shè)置壓力為 100 - 105 kPa，溫度為 121℃，滅菌 15 - 20 分鐘。在滅菌過(guò)程中，要注意防止培養(yǎng)基過(guò)度沸騰導(dǎo)致成分丟失或變性。滅菌完成后，將培養(yǎng)基調(diào)至 4℃保存，待使用前再恢復(fù)至室溫。

三、細(xì)胞復(fù)蘇的規(guī)范操作

從凍存狀態(tài)復(fù)蘇細(xì)胞是細(xì)胞培養(yǎng)的起始步驟，正確的操作可以保證細(xì)胞的活性和正常生長(zhǎng)。首先，準(zhǔn)備一個(gè) 37℃左右的水浴鍋，將含有凍存細(xì)胞的凍存管從液氮罐中迅速取出，立即放入水浴鍋中，并用鑷子快速搖動(dòng)凍存管，使細(xì)胞在 1 - 2 分鐘內(nèi)融化?？焖偃诨梢员M量減少細(xì)胞在低溫到常溫過(guò)程中受到的損傷，提高細(xì)胞的復(fù)蘇率。

然后，用 75% 的酒精對(duì)凍存管外部進(jìn)行消毒，避免外界細(xì)菌、真菌等微生物污染細(xì)胞。在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，將凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液快速加入到含有適量培養(yǎng)基的離心管中，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞均勻分散在培養(yǎng)基中。接下來(lái)進(jìn)行離心操作，一般設(shè)定離心速度為 1000 - 1200rpm，離心時(shí)間為 5 分鐘左右，使細(xì)胞沉淀到離心管底部。離心完成后，小心棄去上清液，注意不要倒掉沉淀的細(xì)胞。加入新鮮的培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打細(xì)胞沉淀，使其重新懸浮在培養(yǎng)基中。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞均勻分布在整個(gè)培養(yǎng)皿表面，放入 37℃、5% CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，讓細(xì)胞逐漸恢復(fù)活性并開始貼壁生長(zhǎng)。

四、細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的觀察與記錄

定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。通常每天至少觀察一次細(xì)胞，觀察內(nèi)容包括細(xì)胞的形態(tài)、顏色、細(xì)胞密度以及培養(yǎng)基的情況等。正常生長(zhǎng)的永生化人牙周膜成纖維細(xì)胞 - SV40 細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多邊形，細(xì)胞邊緣清晰，胞質(zhì)均勻，顏色為淡黃色或透明，細(xì)胞之間相互連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)，細(xì)胞密度會(huì)逐漸增加，培養(yǎng)基的顏色可能會(huì)因?yàn)榧?xì)胞代謝而略有變化，如由紅色逐漸變?yōu)槌壬虻S色。

若觀察到細(xì)胞顏色變深、渾濁，或者出現(xiàn)大量漂浮物，則可能提示細(xì)胞受到細(xì)菌、真菌或支原體等微生物的污染，或者細(xì)胞已經(jīng)死亡、變性。此時(shí)需要立即進(jìn)行處理，如更換培養(yǎng)基、使用抗生素等，嚴(yán)重污染的細(xì)胞可能需要丟棄，防止污染擴(kuò)散到其他細(xì)胞培養(yǎng)體系中。

同時(shí)，要詳細(xì)記錄細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，包括細(xì)胞的形態(tài)變化、細(xì)胞密度的估計(jì)值（如以細(xì)胞占據(jù)培養(yǎng)皿面積的百分比表示）、培養(yǎng)基的更換時(shí)間、細(xì)胞傳代的時(shí)間和比例等信息。這些記錄有助于了解細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)安排提供參考，也有助于在出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)追溯原因，及時(shí)調(diào)整培養(yǎng)條件或采取相應(yīng)的解決措施。

五、細(xì)胞傳代的詳細(xì)步驟

當(dāng)永生化人牙周膜成纖維細(xì)胞 - SV40 生長(zhǎng)到培養(yǎng)皿面積的 80% - 90% 左右時(shí)，需要進(jìn)行傳代操作，以避免細(xì)胞因密度過(guò)高而出現(xiàn)接觸抑制，影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和功能。

傳代前，先用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕沖洗培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，目的是去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基和一些可能影響細(xì)胞傳代的雜質(zhì)。沖洗時(shí)，將適量的 PBS 緩慢加入培養(yǎng)皿，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿使 PBS 均勻覆蓋細(xì)胞表面，然后將 PBS 緩慢傾斜倒出，注意不要用力沖刷細(xì)胞，以免對(duì)細(xì)胞造成損傷。

接著，加入適量的胰蛋白酶 - EDTA 溶液（常用濃度為 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA）到培養(yǎng)皿中，胰蛋白酶可以分解細(xì)胞間的黏附分子，使細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面脫落。將培養(yǎng)皿放入 37℃、5% CO?的培養(yǎng)箱中孵育 1 - 2 分鐘，期間要不時(shí)在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否開始脫落。若細(xì)胞未全脫落，可輕輕敲擊培養(yǎng)皿的側(cè)壁，幫助細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿表面。當(dāng)細(xì)胞大部分脫落形成細(xì)胞懸液后，立即加入適量的含血清培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的作用，因?yàn)橐鹊鞍酌缸饔脮r(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，影響細(xì)胞的活性和后續(xù)生長(zhǎng)。

將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，進(jìn)行離心（條件同前），棄去上清液后，加入新鮮的培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打，使細(xì)胞均勻分散在培養(yǎng)基中。按照適當(dāng)?shù)谋壤ㄈ?1:2 或 1:3）將細(xì)胞懸液分配到新的培養(yǎng)皿中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿使細(xì)胞均勻分布，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。傳代后的細(xì)胞需要特別關(guān)注前 24 小時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)，觀察細(xì)胞是否能夠正常貼壁、恢復(fù)生長(zhǎng)，如有異常及時(shí)采取措施。

六、細(xì)胞凍存的標(biāo)準(zhǔn)化流程

對(duì)于多余的細(xì)胞或需要長(zhǎng)期保存的細(xì)胞系，凍存是常用的保存方法。凍存前，先用胰蛋白酶消化細(xì)胞并收集細(xì)胞懸液，離心后棄去上清液。加入適量的凍存液（一般凍存液的成分為 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亞砜（DMSO）），輕輕吹打使細(xì)胞均勻分散在凍存液中。將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中，每管一般裝 1 - 1.5ml。然后將凍存管放入程序降溫盒中，使細(xì)胞緩慢降溫。如果沒(méi)有程序降溫盒，可采用手動(dòng)降溫的方法：先將凍存管放置在 4℃環(huán)境下 30 分鐘，再轉(zhuǎn)移到 - 20℃環(huán)境下放置 1 - 2 小時(shí)，最后轉(zhuǎn)移到 - 80℃冰箱中保存 2 - 3 小時(shí)，之后迅速將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮罐中長(zhǎng)期保存。這種緩慢降溫的程序可以減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，降低細(xì)胞在凍存過(guò)程中受到的損傷，提高細(xì)胞的復(fù)蘇率。

七、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的操作要點(diǎn)

（一）基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)操作

該細(xì)胞系常用于基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，以研究特定基因在細(xì)胞中的功能。在進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染前，要確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞密度在 70% - 80% 左右較為合適。對(duì)于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，常用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法。首先，將質(zhì)粒 DNA 和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑按照一定比例（如 1:2 或 1:3）在無(wú)血清培養(yǎng)基中混合，室溫孵育 15 - 30 分鐘，使脂質(zhì)體與質(zhì)粒形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿使復(fù)合物均勻分布。轉(zhuǎn)染后 6 - 8 小時(shí)，可更換為含有血清的培養(yǎng)基，以維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。一般在轉(zhuǎn)染后 24 - 72 小時(shí)，根據(jù)所轉(zhuǎn)染基因的特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)需求，通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率（如果質(zhì)粒攜帶熒光報(bào)告基因）或進(jìn)行相關(guān)基因功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，如檢測(cè)基因表達(dá)水平（采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 或 Western blot 等方法）或細(xì)胞生物學(xué)功能變化（如細(xì)胞增殖、遷移、分化等實(shí)驗(yàn)）。

（二）細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)操作

永生化人牙周膜成纖維細(xì)胞 - SV40 在牙周組織的修復(fù)和再生過(guò)程中，其遷移能力是一個(gè)重要的生物學(xué)功能。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)可用于研究影響細(xì)胞遷移的各種因素，如細(xì)胞外基質(zhì)成分、細(xì)胞因子、藥物等。常用的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)方法有劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)。

在劃痕實(shí)驗(yàn)中，待細(xì)胞在培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)至接近 confluent（即細(xì)胞幾乎鋪滿培養(yǎng)皿表面）時(shí)，使用無(wú)菌的 10μl 移液槍頭或細(xì)胞刮刀在細(xì)胞層中央輕輕劃一條直線，制造一個(gè)細(xì)胞空白區(qū)域，即“劃痕”。用 PBS 小心沖洗培養(yǎng)皿，去除劃痕處脫落的細(xì)胞碎片，然后加入不含血清的培養(yǎng)基（因?yàn)檠逯械哪承┏煞挚赡軙?huì)刺激細(xì)胞增殖，干擾遷移結(jié)果的判斷）。將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，在不同時(shí)間點(diǎn)（如 0 小時(shí)、6 小時(shí)、12 小時(shí)、24 小時(shí)等）取出培養(yǎng)皿，在顯微鏡下拍照記錄劃痕處細(xì)胞的遷移情況。通過(guò)測(cè)量劃痕寬度的變化或計(jì)算遷移細(xì)胞的數(shù)量，可以定量分析細(xì)胞的遷移能力。

Transwell 小室實(shí)驗(yàn)則是在一個(gè)特殊的雙層培養(yǎng)裝置中進(jìn)行。上層小室的底部鋪有一層聚碳酸酯膜，該膜上可以涂有或不涂有細(xì)胞外基質(zhì)成分（如膠原蛋白、纖維連接蛋白等），以模擬體內(nèi)細(xì)胞遷移的微環(huán)境。下層小室中加入含有一定濃度細(xì)胞因子或藥物的培養(yǎng)基作為化學(xué)趨向因子，吸引上層小室中的細(xì)胞向下游遷移。將永生化人牙周膜成纖維細(xì)胞 - SV40 種植到上層小室中，放入培養(yǎng)箱孵育一定時(shí)間（如 12 - 24 小時(shí)）。孵育結(jié)束后，用棉簽輕輕擦去上層小室表面未遷移的細(xì)胞，對(duì)遷移至下層小室或膜下表面的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色，然后在顯微鏡下計(jì)數(shù)。通過(guò)比較不同實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的遷移細(xì)胞數(shù)量，可以評(píng)估各種因素對(duì)細(xì)胞遷移的影響。

（三）細(xì)胞與材料相互作用實(shí)驗(yàn)操作

在牙周組織工程研究中，研究細(xì)胞與生物材料的相互作用是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。將永生化人牙周膜成纖維細(xì)胞 - SV40 種植到不同的生物材料表面（如羥基磷灰石、聚乳酸 - 羥基乙酸共聚物等），可以觀察細(xì)胞在材料表面的黏附、增殖、分化以及細(xì)胞外基質(zhì)分泌等情況，從而評(píng)估材料的生物相容性和對(duì)牙周組織修復(fù)的支持作用。

在進(jìn)行這類實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先需要對(duì)生物材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚砗蜏缇?，確保材料表面清潔、無(wú)毒且適合細(xì)胞生長(zhǎng)。將材料樣品放置在培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后將細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N到材料表面。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育一段時(shí)間后，通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞在材料表面的形態(tài)和分布情況，了解細(xì)胞與材料的初始黏附狀態(tài)。同時(shí)，可以采用一系列的細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)方法，如細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK - 8）檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，阿爾辛藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺聚糖的分泌量，免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞骨架蛋白（如 F - actin）的排列和相關(guān)分化標(biāo)志蛋白（如 collagen type I）的表達(dá)等，綜合評(píng)估細(xì)胞與材料之間的相互作用效果，進(jìn)而優(yōu)化生物材料的性能，為牙周組織工程的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。