百歐博偉生物：細(xì)胞自噬（autophagy）的染色實(shí)驗(yàn)通常依賴于熒光探針或抗體標(biāo)記，以觀察自噬體（autophagosome）或溶酶體（lysosome）的動(dòng)態(tài)變化。以下是幾種常用的細(xì)胞自噬染色實(shí)驗(yàn)步驟，包括MDC染色、LysoTracker染色和自噬檢測試劑盒等方法。

一、MDC（Monodansylcadaverine）染色

原理：MDC是一種疏水性熒光染料，可選擇性標(biāo)記自噬體膜的脂雙層結(jié)構(gòu)。

步驟：

細(xì)胞處理：

將細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿或細(xì)胞爬片中，待其貼壁后，進(jìn)行自噬誘導(dǎo)或抑制。

染色：

配制MDC工作液（終濃度50 μM，用無血清培養(yǎng)基或PBS稀釋）。

吸去原培養(yǎng)基，加入MDC工作液，37℃避光孵育15-30分鐘。

洗滌：

吸去染色液，用預(yù)熱的PBS輕柔洗滌細(xì)胞3次（每次5分鐘），去除未結(jié)合的染料。

觀察：

立即用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察（激發(fā)波長335 nm，發(fā)射波長525 nm）。

注意：MDC染色需活細(xì)胞觀察，避免固定（固定會(huì)破壞自噬體結(jié)構(gòu)）。

二、LysoTracker染色（溶酶體標(biāo)記）

原理：LysoTracker標(biāo)記酸性細(xì)胞器，用于觀察自噬體與溶酶體融合。

步驟：

細(xì)胞處理：

同MDC步驟，誘導(dǎo)或抑制自噬后，準(zhǔn)備染色。

染色：

將LysoTracker Red或 Green（終濃度50-100 nM）用培養(yǎng)基稀釋，避光條件下37℃孵育30分鐘。

洗滌：

用PBS洗滌3次，去除多余染料。

固定（可選）：

若需固定，用4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS洗滌后封片。

注意：LysoTracker適用于活細(xì)胞或固定后細(xì)胞，但固定可能影響溶酶體酸性環(huán)境。

三、CYTO-ID® 自噬檢測試劑盒（特異性標(biāo)記自噬體）

原理：CYTO-ID® 是一種綠色熒光染料，特異性標(biāo)記自噬體膜，不與溶酶體結(jié)合。

步驟（以試劑盒說明書為準(zhǔn)，以下為通用流程）：

細(xì)胞處理：

誘導(dǎo)或抑制自噬后，用預(yù)熱的PBS洗滌細(xì)胞1次。

染色：

加入CYTO-ID® 染色液（1:1000稀釋于培養(yǎng)基或緩沖液），37℃避光孵育30分鐘。

洗滌：

用1× Assay Buffer洗滌2次，每次5分鐘。

核染色（可選）：

加入33342（1 μg/mL）染色5分鐘。

觀察：

熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測（CYTO-ID® Ex/Em=480/530 nm）。

優(yōu)勢：適用于活細(xì)胞、高特異性、可定量分析。

四、免疫熒光染色（LC3抗體標(biāo)記）

原理：通過抗體標(biāo)記LC3蛋白（自噬體標(biāo)志物），區(qū)分LC3-I（胞質(zhì)）和LC3-II（自噬體膜結(jié)合形式）。

步驟：

細(xì)胞處理：同前。

固定：4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS洗滌。

透化：0.1% Triton X-100處理10分鐘，PBS洗滌。

封閉：5% BSA封閉1小時(shí)。

一抗孵育：抗LC3抗體（1:200-1:500稀釋）4℃過夜。

二抗孵育：熒光標(biāo)記二抗，避光室溫1小時(shí)。

核染色：DAPI（1 μg/mL）染色5分鐘。

封片觀察：抗熒光淬滅劑封片，共聚焦顯微鏡觀察LC3 puncta（斑點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)）。

五、注意事項(xiàng)

對照設(shè)置：

陽性對照（自噬誘導(dǎo)劑如雷帕霉素、EBSS饑餓培養(yǎng)基）；

陰性對照（自噬抑制劑如氯喹）。

時(shí)間點(diǎn)優(yōu)化：自噬是動(dòng)態(tài)過程，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇合適的時(shí)間點(diǎn)（如處理0、6、12、24小時(shí)）。

避免光漂白：熒光染料需避光操作，盡快觀察。

定量分析：

使用軟件統(tǒng)計(jì)熒光斑點(diǎn)數(shù)量或面積；

流式細(xì)胞儀定量CYTO-ID® 熒光強(qiáng)度。

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