在細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，永生化人胰腺間充質(zhì)干細胞 - hTERT（Immortalized Human Pancreatic Mesenchymal Stem Cells - hTERT）是一種具有重要研究價值的細胞系。以下從多個方面詳細介紹其操作使用要點：

細胞特性概覽

這種細胞系是通過將人胰腺間充質(zhì)干細胞與人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）進行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)而獲得永生化特性的。其具備以下關(guān)鍵特性：

• 永生化能力 ：引入 hTERT 基因后，細胞能夠持續(xù)表達端粒酶，從而維持端粒長度，突破正常細胞的 Hayflick 極限，實現(xiàn)無限增殖，為長期實驗提供穩(wěn)定細胞來源。

• 干細胞屬性保持 ：依然保留間充質(zhì)干細胞的多向分化潛能，可分化為多種細胞類型，同時維持對胰腺組織再生修復(fù)的支持作用，這使其在糖尿病研究、胰腺組織工程以及再生醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域具有不可替代的地位。

培養(yǎng)環(huán)境搭建

• 培養(yǎng)基選擇 ：常用的培養(yǎng)基為 PriGrow III 添加 10% 胎牛血清（FBS）以及 1% 青霉素 / 鏈霉素溶液。依據(jù)不同實驗需求，也可采用含 10% FBS 和 1% 青霉素 / 鏈霉素的 DMEM/F12 培養(yǎng)基。

• 培養(yǎng)容器準備 ：推薦使用經(jīng)處理的培養(yǎng)容器，如 PriCoat™ T25 培養(yǎng)瓶或 Applied Cell 細胞外基質(zhì)涂層培養(yǎng)瓶，這類容器能為細胞提供良好的附著表面，利于細胞生長與粘附。

• 培養(yǎng)環(huán)境條件 ：將培養(yǎng)瓶置于 37℃、5% CO? 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此環(huán)境有助于保持培養(yǎng)基 pH 值穩(wěn)定以及細胞正常的新陳代謝。

凍存與復(fù)蘇策略

• 凍存操作 ：采用含 10% DMSO 的培養(yǎng)基或?qū)ｉT凍存液作為凍存介質(zhì)。將細胞懸浮液分裝入凍存管，每管約 1×10? 個細胞。凍存過程可采用程序降溫法，先置于 4℃ 30 分鐘，再轉(zhuǎn)移至 - 20℃ 30 分鐘，最后放入液氮中長期保存；或利用凍存盒，置于 - 80℃冰箱過夜后轉(zhuǎn)入液氮。

• 復(fù)蘇流程 ：從液氮中取出凍存管，迅速置于 37℃水浴快速解凍，同時輕搖凍存管。解凍后，立即將細胞懸液轉(zhuǎn)移至含適量預(yù)溫培養(yǎng)基的離心管，吹打均勻后，以 125xg 離心 5 分鐘。棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，接種至預(yù)先準備的培養(yǎng)瓶，加入培養(yǎng)基，放入 37℃、5% CO? 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

傳代操作規(guī)范

• 傳代時機把控 ：當細胞在培養(yǎng)容器中的生長密度達到約 80% 時，便可進行傳代。通常每周可傳代 1 至 2 次，但具體頻率需根據(jù)細胞生長狀態(tài)和實驗需求靈活調(diào)整。

• 傳代具體步驟 ：先吸除舊培養(yǎng)基，用 PBS 潤洗細胞以去除雜質(zhì)。接著加入 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 溶液，在顯微鏡下觀察，待大部分細胞脫落，立即加入等體積培養(yǎng)基終止胰蛋白酶作用。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，125xg 離心 5 分鐘后，棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，按 1:2 至 1:4 比例分裝至新培養(yǎng)瓶，加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。

實驗操作注意事項

• 無菌操作原則 ：在細胞培養(yǎng)的各個環(huán)節(jié)，包括培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇和傳代等，都必須嚴格遵循無菌操作，以防微生物污染，確保細胞健康生長。

• 細胞狀態(tài)監(jiān)測 ：定期觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài)，繪制生長曲線，及時發(fā)現(xiàn)并處理諸如污染、生長異常等問題。

• 培養(yǎng)基更換頻率 ：依據(jù)細胞生長速度和實驗需求，一般每 2 至 3 天更換一次培養(yǎng)基，以保證細胞獲取充足營養(yǎng)，維持良好生長態(tài)勢。