永生化人胰腺間充質(zhì)干細胞 - Ras（Immortalized Human Pancreatic Mesenchymal Stem Cells - Ras）是一種具有重要研究價值的細胞系，以下是其詳細的操作使用指南：

培養(yǎng)條件

• 培養(yǎng)基配置 ：常采用 DMEM/F12 培養(yǎng)基，添加 10% 胎牛血清（FBS）以及 1% 青霉素 - 鏈霉素溶液。也可根據(jù)具體實驗需求，添加特定的生長因子和營養(yǎng)成分，如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白等，以滿足細胞的生長需求。

• 培養(yǎng)容器 ：推薦使用經(jīng)特殊處理的培養(yǎng)容器，如 PriCoat™ T25 培養(yǎng)瓶或 Applied Cell 細胞外基質(zhì)涂層培養(yǎng)瓶，這些容器能為細胞提供良好的附著表面，有利于細胞的生長和粘附。

• 培養(yǎng)環(huán)境 ：將培養(yǎng)瓶置于 37℃、5% CO? 的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，濕度保持在 70%-80%，這樣的環(huán)境有助于維持培養(yǎng)基的 pH 值和細胞的正常代謝。

凍存與復(fù)蘇

• 凍存操作 ：使用含 10% DMSO 的培養(yǎng)基或?qū)ｉT的凍存液作為凍存介質(zhì)。將細胞懸浮液分裝于凍存管中，每管 1×10? 個細胞左右。凍存時，可采用程序降溫法，先置于 4℃ 30 分鐘，再轉(zhuǎn)移至 - 20℃ 30 分鐘，最后放入液氮中長期保存。也可使用凍存盒，將凍存管放入凍存盒中，放置 - 80℃冰箱過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮保存。

• 復(fù)蘇流程 ：從液氮中取出凍存管，迅速放入 37℃水浴中快速解凍，同時輕輕搖動凍存管以加速解凍過程。解凍后的細胞懸液應(yīng)立即轉(zhuǎn)移至含有適量預(yù)溫培養(yǎng)基的離心管中，輕輕吹打混勻后，以 125xg 的速度離心 5 分鐘。棄去上清液，用新鮮的培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，將細胞懸液接種到預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)瓶中，加入適量的培養(yǎng)基，置于 37℃、5% CO? 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

傳代操作

• 傳代時機 ：當(dāng)細胞在培養(yǎng)容器中的生長密度達到 80% 左右時，即可進行傳代操作。一般來說，每周可進行 1 至 2 次傳代，但具體的傳代頻率還需根據(jù)細胞的生長狀態(tài)和實驗需求進行調(diào)整。

• 傳代步驟 ：首先吸除培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，加入適量的 PBS 潤洗細胞，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液，在顯微鏡下觀察細胞，待細胞大部分脫落時，加入等體積的培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的作用。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以 125xg 的速度離心 5 分鐘，棄去上清液，用新鮮的培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，按照 1:2 至 1:4 的比例將細胞懸液分裝到新的培養(yǎng)瓶中，并加入適量的培養(yǎng)基，繼續(xù)進行培養(yǎng)。

注意事項

• 無菌操作 ：在整個操作過程中，包括培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇和傳代等環(huán)節(jié)，都必須嚴格遵守?zé)o菌操作原則，以防止微生物的污染，確保細胞的健康生長。

• 細胞狀態(tài)監(jiān)測 ：定期觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，記錄細胞的生長曲線，及時發(fā)現(xiàn)并處理可能出現(xiàn)的問題，如細胞污染、生長異常等。

• 培養(yǎng)基更換 ：根據(jù)細胞的生長速度和實驗需求，一般每 2 至 3 天更換一次培養(yǎng)基，以提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，維持細胞的良好生長狀態(tài)。