在神經(jīng)科學研究領域，永生化大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞 - SV40（Immortalized Rat Brain Microvascular Endothelial Cells - SV40）是一種具價值的細胞模型，為深入探究血腦屏障機制及相關疾病提供了有力支持。以下是關于該細胞系操作使用的詳細指南。

一、細胞培養(yǎng)條件

（一）培養(yǎng)基配制

該細胞系通常使用內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，如 ECM 基礎培養(yǎng)基 +5% 胎牛血清（FBS）+ 內(nèi)皮細胞生長添加劑。培養(yǎng)基中需添加青霉素 - 鏈霉素雙抗溶液，防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌和真菌污染。

（二）培養(yǎng)環(huán)境

細胞培養(yǎng)應在 37℃、5% CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進行，這樣的環(huán)境有助于維持培養(yǎng)基的 pH 值穩(wěn)定，并為細胞提供適宜的生長溫度和氣體條件，以模擬體內(nèi)生理環(huán)境，確保細胞的正常生長和代謝。

二、細胞傳代操作

（一）傳代比例

一般建議將細胞以 1:2 至 1:3 的比例進行傳代培養(yǎng)。當細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶底面積的 80%-90% 時，即可進行傳代操作，以防止細胞過度擁擠導致生長抑制和細胞狀態(tài)下降。

（二）胰酶消化

使用 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液進行細胞消化。在消化過程中，需密切觀察細胞形態(tài)變化，一般在 37℃下消化 1-3 分鐘，待細胞間隙增大、細胞邊緣變圓并開始從培養(yǎng)瓶壁上脫落時，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細胞使其全脫落并形成均勻的細胞懸液，然后進行分瓶培養(yǎng)。

三、細胞凍存與復蘇

（一）細胞凍存

1. 凍存培養(yǎng)基配制 ：凍存培養(yǎng)基一般由基礎培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和二甲基亞砜（DMSO）組成，比例為 90% FBS + 10% DMSO。

2. 凍存操作 ：將細胞收集并離心，棄去上清液，用凍存培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度至 5×10^6^-1×10^7^ cells/mL 左右，將細胞懸液分裝于凍存管中，每管 1 mL。將凍存管置于程序降溫盒中，放入 - 80℃冰箱中過夜，次日轉移至液氮中長期保存。緩慢降溫的過程有助于細胞逐漸適應低溫環(huán)境，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而提高細胞復蘇后的存活率。

（二）細胞復蘇

1. 快速解凍 ：從液氮中取出凍存管，立即放入 37℃水浴中快速搖晃解凍，使細胞在 45-90 秒內(nèi)全解凍。

2. 細胞處理 ：將凍存管從水浴中取出后，用 70% 酒精消毒管外壁，移入無菌超凈工作臺內(nèi)。將凍存管中的細胞懸液全部轉移到含有 9 mL 全培養(yǎng)基的離心管中，用移液管輕輕吹打混勻，使凍存管中的 DMSO 濃度稀釋至 10% 以下，以減少 DMSO 對細胞的毒性作用。然后在 1000rpm 條件下離心 3-5 分鐘，棄去上清液，加入適量全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，放入 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

四、細胞基因改造機制

該細胞系是通過將 SV40 大 T 抗原基因導入大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞而獲得永生化。SV40 大 T 抗原能夠與細胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)相互作用，其中包括視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（RB）和 p53 蛋白。正常情況下，RB 蛋白通過與 E2F 轉錄因子結合，抑制細胞周期相關基因的轉錄，使細胞停滯在 G1 期，阻止細胞進入 S 期進行 DNA 復制，從而抑制細胞增殖。而 p53 蛋白則是一種重要的腫瘤抑制蛋白，在細胞受到 DNA 損傷等應激信號時，p53 蛋白可激活相關基因的表達，使細胞周期停滯，為 DNA 修復提供時間，若 DNA 損傷無法修復，p53 蛋白則會誘導細胞凋亡，以維持細胞基因組的穩(wěn)定性。然而，SV40 大 T 抗原可以分別與 RB 蛋白和 p53 蛋白結合，使其失去正常的生理功能，細胞周期調(diào)控失效，細胞得以突破正常的增殖限制，實現(xiàn)無限增殖。

五、細胞應用

（一）血腦屏障機制研究

永生化大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞 - SV40 是研究血腦屏障機制的重要細胞模型。血腦屏障是由腦微血管內(nèi)皮細胞、細胞外基質(zhì)、周細胞和星形膠質(zhì)細胞足突等組成的復合體，具有限制物質(zhì)從血液進入大腦的作用，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關重要。通過使用該細胞系，可深入探究血腦屏障的形成、維持以及在病理狀態(tài)下的改變機制，如細胞間緊密連接的形成與調(diào)節(jié)、轉運系統(tǒng)的功能等。

（二）藥物滲透性測試

該細胞系可用于藥物穿透血腦屏障的研究。在藥物研發(fā)過程中，了解藥物能否有效穿透血腦屏障是開發(fā)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物的關鍵環(huán)節(jié)。將永生化大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞 - SV40 培養(yǎng)在特殊的實驗裝置中，如 Transwell 小室，模擬血腦屏障的結構和功能，然后將藥物加入到上室，通過檢測藥物在下室的濃度變化，評估藥物的滲透性，為篩選能夠有效透過血腦屏障的藥物提供實驗依據(jù)。