永生化犬真皮成纖維細胞 - hTERT 是一種重要的細胞模型，以下是其操作使用方面的詳細指南。

一、細胞培養(yǎng)條件

（一）培養(yǎng)基配制

該細胞系推薦使用 DMEM 高糖型培養(yǎng)基，其中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素 - 鏈霉素雙抗溶液。FBS 能為細胞生長提供必要的營養(yǎng)物質、激素和生長因子等，而雙抗溶液則可有效防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌和真菌污染。

（二）培養(yǎng)環(huán)境

細胞應在 37℃、5% CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此環(huán)境有助于維持培養(yǎng)基的 pH 值穩(wěn)定，同時為細胞提供適宜的生長溫度和氣體條件，使其 metabolic processes 運行更貼近體內(nèi)生理環(huán)境，從而確保細胞正常生長和代謝。

二、細胞傳代操作

（一）傳代比例

建議將細胞以 1:3 至 1:4 的比例進行傳代培養(yǎng)。當細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶底面積的 80% - 90% 時，即可進行傳代，以避免細胞過度擁擠導致生長抑制和細胞狀態(tài)下降。

（二）胰酶消化

使用 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液進行細胞消化。消化時，需密切觀察細胞形態(tài)變化，一般在 37℃下消化 1 - 3 分鐘，待細胞間隙增大、細胞邊緣變圓并開始從培養(yǎng)瓶壁上脫落時，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。然后輕輕吹打細胞，使其全脫落并形成均勻的細胞懸液，再進行分瓶培養(yǎng)。

三、細胞凍存與復蘇

（一）細胞凍存

凍存培養(yǎng)基一般由基礎培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和二甲基亞砜（DMSO）組成，比例為 90% FBS + 10% DMSO。將細胞收集并離心，棄去上清液后，用凍存培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度至 5×10? - 1×10? cells/mL 左右，分裝于凍存管中，每管 1 mL。將凍存管置于程序降溫盒中，放入 - 80℃冰箱中過夜，次日轉移至液氮中長期保存。緩慢降溫有助于細胞逐漸適應低溫環(huán)境，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而提高細胞復蘇后的存活率。

（二）細胞復蘇

從液氮中取出凍存管，立即放入 37℃水浴中快速搖晃解凍，使細胞在 1 分鐘左右全解凍。用 70% 酒精消毒管外壁后，移入無菌超凈工作臺內(nèi)。將凍存管中的細胞懸液全部轉移到含有 9 mL 全培養(yǎng)基的離心管中，用移液管輕輕吹打混勻，使 DMSO 濃度稀釋至 10% 以下，以降低其對細胞的毒性。接著在 1000rpm 條件下離心 5 分鐘，棄去上清液，加入適量全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，放入 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

四、細胞基因改造機制

該細胞系是通過將 hTERT 基因導入犬真皮成纖維細胞而獲得永生化。正常細胞的分裂次數(shù)有限，這是因為每次細胞分裂時，染色體末端的端粒會縮短，當端?？s短到一定程度時，細胞就會進入衰老狀態(tài)并停止分裂。而 hTERT 基因是端粒酶的催化亞基，可使端粒延長，從而維持細胞的增殖能力，使細胞突破正常的增殖極限，實現(xiàn)無限增殖。

五、細胞應用

（一）皮膚修復研究

永生化犬真皮成纖維細胞 - hTERT 是研究皮膚修復機制的重要細胞模型。成纖維細胞在皮膚損傷后的修復過程中發(fā)揮關鍵作用，它們參與細胞外基質的合成與重塑，促進傷口愈合。利用該細胞系，可深入探究影響皮膚修復的各種因素，如細胞生長因子、信號通路等，為開發(fā)促進皮膚再生和修復的治療方法提供理論基礎。

（二）藥物篩選

該細胞系可用于藥物篩選，用于篩選能夠調(diào)節(jié)細胞增殖、促進皮膚修復或改善皮膚相關疾病病理特征的藥物。由于細胞具有永生化特性，可在較長時間內(nèi)穩(wěn)定地進行藥物處理和實驗觀察，提高了藥物篩選的效率和可靠性。