一、背景

大鼠真皮成纖維細(xì)胞分離自大鼠皮膚組織采用酶解法制備而來(lái)，波形蛋白（vimentin）免疫熒光染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞純度可達(dá)90%以上，且不含有hiv-1、hbv、hcv、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

真皮主要由成纖維細(xì)胞及其產(chǎn)生的纖維、基質(zhì)構(gòu)成，并有血管、淋巴管、神經(jīng)、皮膚附屬器及其他細(xì)胞成分。該細(xì)胞主要分布于黏膜和皮下疏松結(jié)締組織，胞質(zhì)內(nèi)富含嗜堿性顆粒，細(xì)胞表面能夠表達(dá)高親和力fcεri，可結(jié)合游離ige，參與i型超敏反應(yīng)。

大鼠真皮成纖維細(xì)胞多呈長(zhǎng)梭形，具有突起，細(xì)胞胞體較大，胞質(zhì)弱嗜堿性，胞核較大呈橢圓形，染色質(zhì)疏松色淺，核仁明顯。剛分離的大鼠真皮成纖維細(xì)胞呈圓形，較亮，培養(yǎng)40min左右貼壁，12～24 h左右伸展，36～48h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。分離純化3d后接近融合，并彼此連接成網(wǎng)狀。

二、細(xì)胞操作

1、取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時(shí)或者過(guò)夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2、待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3、細(xì)胞傳代

1)吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2)添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入培養(yǎng)液終止消化；

3)用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代，然后補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基至5mL，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4)待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的培養(yǎng)基。

三、應(yīng)用

用于十全大補(bǔ)湯配伍不同劑量肉桂對(duì)氧化損傷大鼠真皮成纖維細(xì)胞的影響研究：

探討十全大補(bǔ)湯配伍不同劑量肉桂對(duì)氧化損傷大鼠真皮成纖維細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用,從細(xì)胞水平研究十全大補(bǔ)湯配伍不同劑量肉桂對(duì)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的慢性難愈性創(chuàng)面的作用機(jī)制。

方法：采用原代培養(yǎng)組織塊法獲得大鼠真皮成纖維細(xì)胞。采用十全大補(bǔ)湯原方及調(diào)整肉桂劑量所得的三組方藥灌胃Wistar大鼠,制備5組不同的含藥血清,分別為正常對(duì)照組、去肉桂組、原方組、2倍肉桂組及4倍肉桂組。采用一定濃度的H2O2刺激大鼠真皮成纖維細(xì)胞,制備細(xì)胞氧化損傷模型。用各組大鼠血清對(duì)氧化損傷的大鼠真皮成纖維細(xì)胞實(shí)施干預(yù),采用MTT法檢測(cè)四組藥物對(duì)氧化損傷的大鼠真皮成纖維細(xì)胞增殖的影響；采用PI單染法和PI/Annexin V雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)四組藥物對(duì)氧化損傷的大鼠真皮成纖維細(xì)胞周期和凋亡的影響；采用DCFH-DA探針和JC-1探針結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)四組藥物對(duì)氧化損傷的大鼠真皮成纖維細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和線粒體膜電位的影響。

結(jié)果：1、濃度在100-1000umol/L范圍內(nèi)的H202刺激大鼠真皮成纖維細(xì)胞30min,可明顯抑制細(xì)胞增殖,細(xì)胞增殖抑制率（IR）隨H202濃度增高而依次增高。當(dāng)H202濃度為500umol/L時(shí),IR約為50%,可作為誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷的合適濃度。

2、500umol/L H2O2刺激大鼠真皮成纖維細(xì)胞30mmin后,MTT法測(cè)得的OD值明顯降低；GO/G1期細(xì)胞比例明顯增高,S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯降低；細(xì)胞凋亡率明顯增高；線粒體膜電位明顯降低；細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著上升。

3、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果中,氧化損傷的大鼠真皮成纖維細(xì)胞給予藥物干預(yù)24h后,10%血清濃度組中2倍肉桂組和4倍肉桂組OD值升高；15%濃度組中2倍肉桂組OD值明顯升高。藥物干預(yù)48h后,5%濃度組中2倍肉桂組和4倍肉桂組OD值明顯升高；10%濃度組中2倍肉桂組OD值明顯升高。在四個(gè)用藥組中,2倍肉桂組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的OD值均為。

4、細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果中,氧化損傷的大鼠真皮成纖維細(xì)胞給予藥物干預(yù)24h后,四個(gè)用藥組G0/G1期細(xì)胞比例均顯著降低,S期和G2/M期細(xì)胞比例均顯著增高。藥物干預(yù)48h后,原方組、2倍肉桂組和4倍肉桂組G0/G1期細(xì)胞比例降低,S期和G2/M期細(xì)胞比例增高。在四個(gè)用藥組中,2倍肉桂組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的細(xì)胞增殖指數(shù)均為。

5、細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果中,氧化損傷的大鼠真皮成纖維細(xì)胞給予藥物干預(yù)24h及48h后,四個(gè)用藥組細(xì)胞凋亡率均明顯降低。在四個(gè)用藥組中,2倍肉桂組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的細(xì)胞凋亡率均為。

6、線粒體膜電位檢測(cè)結(jié)果中,氧化損傷的大鼠真皮成纖維細(xì)胞給予藥物干預(yù)24h后,只有2倍肉桂組明顯提高了線粒體膜電位。藥物干預(yù)48h后,四個(gè)用藥組對(duì)線粒體膜電位無(wú)明顯影響。

7、活性氧檢測(cè)結(jié)果中,氧化損傷的大鼠真皮成纖維細(xì)胞給予藥物干預(yù)24h及48h后,四個(gè)用藥組活性氧水平均顯著降低。

結(jié)論：十全大補(bǔ)湯配伍不同劑量肉桂可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、清除細(xì)胞內(nèi)活性氧的途徑,對(duì)氧化損傷大鼠真皮成纖維細(xì)胞起到保護(hù)作用。

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