鏈霉親和素磁珠的FAQ

1.Q:每個(gè)鏈霉親和素分子上有多少個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)?

A:鏈霉親和素是一種由四個(gè)亞基組成的蛋白，每個(gè)亞基包含一個(gè)針對(duì)生物素的高親和力結(jié)合位點(diǎn)(Ko=10-15M)。鏈霉親和素的生物素結(jié)合性能與親和素(avidin)相同，但它的等電點(diǎn)更低(pl =5)并且不含糖基，因此具有更低的非特異性結(jié)合。

2.Q:哪些緩沖液適合用于將生物素化分子與鏈霉親和素磁珠結(jié)合?

A:對(duì)于生物素化蛋白以及大部分生物素化分子，PBS是首先選擇。如需結(jié)合生物素化的核酸分子，我們推薦以下緩沖液用于結(jié)合與洗滌(B&W):10.0 mM Tris-HCI (pH 7.5)+1.0 mM EDTA+2.0 M NaCl。

3.Q:如何對(duì)鏈霉親和素磁珠上結(jié)合的生物素化分子進(jìn)行測(cè)定?

A:要測(cè)定鏈霉親和素磁珠上結(jié)合生物素化分子的量，需要對(duì)上清液中未結(jié)合的分子進(jìn)行定量。對(duì)于核酸分子可以使用OD值或者定量凝膠電泳。對(duì)于蛋白分子可以使用BCA法之類的蛋白定量檢測(cè)方法。此外也可以對(duì)分子進(jìn)行放射性同位素或者熒光標(biāo)記，然后檢測(cè)磁珠上結(jié)合的分子或者上清液中未結(jié)合的分子的信號(hào)值。

4.Q:鏈霉親和素磁珠能否直接用于PCR實(shí)驗(yàn)中?

A:少量的磁珠不會(huì)對(duì)PCR體系產(chǎn)生抑制作用。但各個(gè)PCR體系對(duì)于磁珠濃度耐受的上限需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

5.Q:當(dāng)磁珠表面結(jié)合了生物素化的雙鏈DNA時(shí)，如何將非生物素化的一條單鏈從上面解離下來?

A:有兩種方法可以解離非生物素化的單鏈。方法中試劑的用量基于20 μL的鏈霉親和素磁珠用量。每種方法都會(huì)使得極少量的生物素化單鏈從磁珠表面解離。如果需要沒有解離的結(jié)果可以考慮使用帶有兩個(gè)生物素的序列或者將氨基末端的序列偶聯(lián)到羧基磁珠上。

1)加熱法

·用50μL1xSSC緩沖液*洗滌磁珠。

·將磁珠重懸于另一50 μL1xSSC緩沖液中。在95℃孵育5分鐘。

·將磁珠置于磁力架上吸附1-2分鐘。將上清液移到另一個(gè)管子里。

·非生物素化的單鏈在上清液中。

2)堿洗法

·用50μL1xSSC緩沖液*洗滌磁珠。

·將磁珠重懸于20μL的新鮮配制的0.15 M NaOH溶液中。

·在室溫下孵育10分鐘。將磁珠置于磁力架上吸附1-2分鐘。將上清液移到另一個(gè)管子里。

·非生物素化的單鏈在上清液中。將其中加入2.2 μL的10xTE,pH7.5和1.3μL的1.25 M醋酸溶液將pH調(diào)至中性。解離完成后，用50 μL的0.1M NaOH溶液、50μL的B&W緩沖液和50μL的TE緩沖液各洗滌磁珠一次。

*1x SSC緩沖液的配制：緩沖液含有0.15 M NaCl,0.015 M檸檬酸鈉。將鹽溶解于800 mL的水中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0,然后加水到總體積1 L。

6.Q:如何從鏈霉親和素磁珠上解離生物素化分子?

A:鏈霉親和素-生物素相互作用是已知的非鍵合蛋白分子相互作用力當(dāng)中較強(qiáng)的一個(gè)。二者之間的結(jié)合非常迅速，結(jié)合一旦形成，幾乎不受外界因素(包括很寬的pH范圍、溫度范圍、有機(jī)溶劑以及各種蛋白變性劑)的影響。除非使用一些特殊的變種生物素或者鏈霉親和素蛋白，使得二者之間的親和力降低，能夠用比較溫和的條件解離二者，否則只有非?？量痰臈l件才能將生物素化分子從鏈霉親和素磁珠表面解離。以下給出兩個(gè)示例。

1)解離生物素化核酸分子

將結(jié)合了生物素化核酸分子的鏈霉親和素磁珠在在95%的甲酰胺+10mM的EDTA,pH 8.2中于65℃下孵育5分鐘或者于90℃下孵育2分鐘。用磁吸分離磁珠，上清液中包含了解離下來的核酸分子。

2)解離生物素化蛋白

將結(jié)合了生物素化蛋白的鏈霉親和素磁珠在0.1%SDS或者SDS-PAGE緩沖液中煮沸3分鐘。

7.Q:鏈霉親和素磁珠能否重復(fù)使用?

A:對(duì)于大部分需要解離生物素化分子的實(shí)驗(yàn)，磁珠不能重復(fù)使用。由于鏈霉親和素-生物素的相互作用過強(qiáng)，解離條件往往會(huì)破壞鏈霉親和素分子。不過，如果磁珠是用于DNA-蛋白共沉淀之類實(shí)驗(yàn)，只需溫和的條件即可將DNA與蛋白解離開來的話，磁珠可以重復(fù)使用。

8.Q:如果我要在免疫沉淀實(shí)驗(yàn)后將蛋白從鏈霉親和素磁珠洗脫而不洗脫磁珠上結(jié)合的生物素化抗體，應(yīng)當(dāng)用何種條件?

A:可以使用較為溫和的洗脫條件，例如高鹽(>1M)的緩沖

液或者低pH的緩沖液。像0.1M甘氨酸，pH 2.5-3.0這種洗脫液可以用于解離大多數(shù)的抗原-抗體復(fù)合物。

9.Q:將鏈霉親和素磁珠不加生物素化捕獲分子而直接與樣本混合用作陰性對(duì)照組的時(shí)候，產(chǎn)生了大量的非特異性吸附，這是為什么?

A:在含有各種不同種類分子的樣本中，任何固相載體(包括磁珠)都能通過一系列相互作用吸附這些分子。相互作用的種類包含疏水相互作用、靜電相互作用以及其他種類的相互作用。這些相互作用帶來非特異性吸附并不令人驚異。綜上，將磁珠直接加入樣本中通常用于對(duì)樣本的預(yù)清潔(去除可能產(chǎn)生非特異性吸附的分子)。這并不是一個(gè)好的陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)條件。當(dāng)磁珠表面偶聯(lián)了特異性捕獲分子而后進(jìn)行封閉之后，其非特異性吸附相比于未偶聯(lián)的磁珠會(huì)明顯地降低。如果要做陰性對(duì)照的話，可以嘗試用磁珠偶聯(lián)一個(gè)結(jié)構(gòu)類似但是不會(huì)與目標(biāo)分子產(chǎn)生特異性結(jié)合的捕獲分子。

10.Q:鏈霉親和素分子是否會(huì)從磁珠表面脫落?

A:鏈霉親和素分子是共價(jià)偶聯(lián)到磁珠表面的。不過并不是所有的四個(gè)亞基都共價(jià)偶聯(lián)在磁珠上，一般只有1-2個(gè)亞基是與磁珠表面形成共價(jià)鍵的。像很多具有高級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白一樣，當(dāng)鏈霉親和素受熱的時(shí)候，它也會(huì)發(fā)生變性，亞基會(huì)互相解離。如果鏈霉親和素磁珠被加熱至沸騰溫度，部分的鏈霉親和素蛋白亞基會(huì)從磁珠表面以游離亞基或者亞基聚集體的形式脫落，但共價(jià)偶聯(lián)上去的那部分亞基不會(huì)脫落。當(dāng)鏈霉親和素與生物素結(jié)合時(shí)，這個(gè)復(fù)合物實(shí)際上比鏈霉親和素蛋白本身(亞基之間的結(jié)合)還要穩(wěn)定。在常規(guī)的使用條件下，鏈霉親和素從磁珠表面的脫落是可以忽略不計(jì)的(37℃下2個(gè)月，從磁珠表面脫落的鏈霉親和素不超過總量的0.2%)。