一、細胞培養(yǎng)準備工作

在開展永生化人主動脈內(nèi)皮-SV4細胞培養(yǎng)前，實驗室環(huán)境的無菌性是關鍵。超凈工作臺需提前用紫外線消毒30分鐘以上，以殺滅空氣中的微生物。通風系統(tǒng)開啟后，需維持正壓環(huán)境，防止外界空氣中的雜質(zhì)進入操作區(qū)域。培養(yǎng)容器如培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等，應采用高壓蒸汽滅菌法處理，溫度控制在121℃，壓力15-20psi，持續(xù)15-20分鐘。選擇合適的細胞培養(yǎng)耗材至關重要，培養(yǎng)瓶需具備良好的生物相容性和光學透明度，以確保細胞能夠正常貼壁生長并便于觀察。

培養(yǎng)基是細胞生存的“土壤”，其成分繁多?；A培養(yǎng)基如DMEM或RPMI 1640，為細胞提供碳水化合物、氨基酸和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)。血清作為關鍵補充，通常添加10%-15%胎牛血清，它含有細胞生長因子、激素和黏附因子等。但血清質(zhì)量參差不齊，需根據(jù)細胞特性篩選。若使用含血清培養(yǎng)，細胞生長迅速但存在成分不可控的風險；若用無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境更穩(wěn)定，但成本較高。培養(yǎng)基pH值應維持在7.2-7.4，可添加HEPES緩沖液增強穩(wěn)定性，因細胞代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)可能改變pH值，影響細胞生長。為抑制雜菌生長，常添加青霉素（100U/mL）、鏈霉素（100μg/mL），但過量抗生素會損害細胞活性。

二、細胞復蘇與傳代

細胞復蘇時，需將凍存管從液氮中取出，迅速置于37℃水浴中搖晃至無冰晶。動作要迅速，因為細胞在低溫保存時處于休眠狀態(tài)，快速升溫可減少細胞損傷。復蘇后的細胞用培養(yǎng)基稀釋并離心，去除凍存液中的DMSO，防止其毒性作用。離心力控制在1200rpm，時間5分鐘，過高的離心力會導致細胞破碎。

細胞傳代時，當細胞密度達80%-90%匯合度，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1-2分鐘，直到細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落。胰蛋白酶濃度和消化時間需精準控制，濃度過高或時間過長會破壞細胞表面蛋白，影響細胞后續(xù)生長和功能。消化后的細胞用含血清培養(yǎng)基終止反應，并輕柔吹打制成單細胞懸液，分裝到新的培養(yǎng)瓶中。傳代比例一般為1:2或1:3，給予細胞足夠生長空間，避免過度擁擠導致細胞生長抑制。

三、細胞培養(yǎng)過程中的污染防控與監(jiān)測

細胞培養(yǎng)過程中，污染是“隱形殺手”。細菌污染會使培養(yǎng)基迅速渾濁，細胞形態(tài)異常；真菌污染則表現(xiàn)為培養(yǎng)基表面的絨毛狀或棉絮狀菌落；支原體污染雖無明顯肉眼變化，但會消耗培養(yǎng)基中的精氨酸等營養(yǎng)物質(zhì)，抑制細胞生長。為預防污染，所有培養(yǎng)操作應在無菌環(huán)境下進行，操作人員需嚴格無菌操作。定期更換培養(yǎng)基能有效清除潛在污染物，維持培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定。一旦發(fā)現(xiàn)污染，應立即停止實驗，對受污染的細胞和培養(yǎng)器具進行消毒處理，防止污染擴散。

細胞生長狀態(tài)的監(jiān)測是確保實驗順利的關鍵。顯微鏡觀察是常用方法，健康細胞形態(tài)規(guī)則，貼壁良好，細胞質(zhì)清晰；而受損或老化細胞形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)顆粒增多。定期計數(shù)細胞，可計算細胞倍增時間，評估細胞生長活力。細胞活性檢測方法多樣，MTT法通過檢測細胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性評估細胞活性，操作簡便、結果可靠。流式細胞術可分析細胞周期分布、細胞凋亡率，提供更全面的細胞狀態(tài)信息。

四、細胞凍存與長期保存

長期保存細胞時，凍存液的配制是關鍵。常用凍存液含90%胎牛血清和10%二甲基亞砜（DMSO）。DMSO作為保護劑，能降低細胞內(nèi)水分冰點，減少冰晶形成對細胞的機械損傷。凍存過程需緩慢降溫，可使用程序降溫儀，從室溫以每分鐘1℃的速度降至-80℃，然后轉(zhuǎn)移到液氮罐中?？焖俳禍貢е录毎麅?nèi)水分快速結冰，形成冰晶刺破細胞膜；而緩慢降溫使細胞內(nèi)水分逐漸向外轉(zhuǎn)移，在細胞內(nèi)形成少量小冰晶，減少損傷。液氮罐應定期檢查液氮水平，確保細胞處于-196℃的低溫環(huán)境中長期保存。