RGC-32 deficiency protects endothelial cell from inflammation and attenuates atherosclerosis

Keywords: response gene to complement 32, atherosclerosis, endothelial cells, adhesion molecules, nuclear factor-κB

動脈粥樣硬化作為心血管疾病的主要誘因，其病理進程與內(nèi)皮細胞活化密切相關(guān)?；罨膬?nèi)皮細胞通過表達 ICAM-1、VCAM-1 等黏附分子，介導白細胞與血管內(nèi)皮的相互作用，而 NF-κB 信號對黏附分子的轉(zhuǎn)錄起關(guān)鍵調(diào)控作用。

RGC-32 此前被發(fā)現(xiàn)參與細胞增殖、分化及癌癥等過程，且在高脂飲食誘導的肥胖和肝脂肪變性中起促進作用。最新研究顯示其在人動脈粥樣硬化血管壁中表達并介導血管內(nèi)皮細胞增殖遷移，但其在動脈粥樣硬化和內(nèi)皮炎癥中的功能性作用仍有待探究。

因此，喬治亞大學生理學與藥理學系和湖北醫(yī)科大學人民醫(yī)院內(nèi)分泌科的研究團隊探索了RGC-32 介導動脈粥樣硬化的作用機制。研究結(jié)果發(fā)表在Arterioscler Thromb Vasc Biol期刊題為“RGC-32 deficiency protects endothelial cell from inflammation and attenuates atherosclerosis”。

首先，為檢測 RGC-32 在人類正常血管和動脈粥樣硬化病變中的表達，研究人員使用 RGC-32 抗體或正常兔 IgG（陰性對照）進行免疫組織化學染色。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RGC-32 在人類正常血管中無表達，但其在動脈粥樣硬化病變的早期階段顯著誘導，并在晚期階段高度上調(diào)（圖 1A-1B）。在 ApoE?/?小鼠模型中，高脂飲食可誘導主動脈根部 RGC-32 表達（圖 1C-1D），且其定位集中于血管內(nèi)層。共免疫染色進一步顯示，RGC-32 與內(nèi)皮細胞標志物 CD31 共定位（圖 1E），而與平滑肌細胞標志物 α-SMA 無共定位，表明 RGC-32 主要表達于動脈粥樣硬化病變的內(nèi)皮細胞中。

圖 1    動脈粥樣硬化病變的內(nèi)皮細胞中誘導表達 RGC-32。

為了探究 RGC-32 在動脈粥樣硬化中的作用，研究人員構(gòu)建了 ApoE?/?Rgc32?/?雙敲除小鼠模型。高脂飲食 12 周及普通飼料喂養(yǎng) 1 年的結(jié)果顯示，ApoE?/?Rgc32?/?小鼠中觀察到的動脈粥樣硬化病變面積顯著小于 ApoE?/?小鼠（ 2A-2D）。Rgc32?/?還減少了喂食普通飼料的一歲 ApoE?/?小鼠中自發(fā)形成的動脈粥樣硬化病變的大?。▓D 2E-2H）。進一步分析顯示，RGC-32 缺失并未引起血清脂蛋白組分、甘油三酯水平及體重的顯著變化，肝組織脂質(zhì)沉積和脂肪變性程度也與對照組無差異。這說明 RGC-32 并非通過影響血脂代謝或肝脂肪變來調(diào)控動脈粥樣硬化，其抗動脈粥樣硬化的作用可能源于其他機制。

圖 2    RGC-32 缺失減輕了 ApoE?/? 小鼠中飲食誘導的動脈粥樣硬化。

然后，為了進一步了解 ApoE?/?和 ApoE?/?Rgc32?/?小鼠之間動脈粥樣硬化的差異，研究人員分析了動脈粥樣硬化病變的細胞組成。發(fā)現(xiàn) RGC-32 缺失并未影響病變中膠原和平滑肌細胞的含量及纖維帽厚度，但顯著降低了巨噬細胞在病變中的浸潤程度（圖 3A-3B）。進一步通過巨噬細胞標志物 CD68 與增殖標志物 Ki67 的共免疫熒光染色證實，RGC-32 缺失不影響病變內(nèi)巨噬細胞的增殖（圖 3C-3D），表明其導致巨噬細胞減少的原因可能是抑制了單核細胞的黏附和浸潤過程。

圖 3    RGC-32 缺失抑制了動脈粥樣硬化病變中的巨噬細胞含量。

為了明確駐留血管細胞（如內(nèi)皮細胞）中的 RGC-32 是否促成進動脈粥樣硬化的發(fā)展。研究人員通過骨髓移植實驗構(gòu)建了 RGC-32 缺失的駐留血管細胞（內(nèi)皮細胞等）與正常巨噬細胞的嵌合模型。結(jié)果顯示，當 Rgc32?/?受體小鼠接受 WT 骨髓移植后，其動脈粥樣硬化病變面積和巨噬細胞浸潤程度仍顯著低于 WT 受體小鼠（圖 4A-4F）。且血清脂質(zhì)水平、肝脂肪變性無差異。這表明巨噬細胞來源的 RGC-32 不影響病變發(fā)展，而駐留血管細胞（主要是內(nèi)皮細胞）中的 RGC-32 才是促進動脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素。

圖4    駐留血管細胞中的RGC-32對動脈粥樣硬化的發(fā)展至關(guān)重要。

為了探究 Rgc32?/?減輕巨噬細胞浸潤和動脈粥樣硬化發(fā)展的機制，研究人員培養(yǎng)了來自 WT 和 Rgc32?/?小鼠的原代主動脈內(nèi)皮細胞，并檢測黏附分子的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RGC-32 缺失在體外可顯著抑制原代主動脈內(nèi)皮細胞中 ICAM-1 和 VCAM-1 的表達，但對 P - 選擇素無影響（圖 5A-5B）。在體內(nèi)實驗中，ApoE?/?Rgc32?/?小鼠動脈粥樣硬化病變處的內(nèi)皮細胞 ICAM-1、VCAM-1 表達量也明顯低于對照組 （圖 5C-5D ）。此外，RGC-32 缺失對血管平滑肌細胞的黏附分子表達無顯著作用。這表明RGC-32 主要調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞 ICAM-1 和 VCAM-1 的表達，介導單核細胞與內(nèi)皮細胞的黏附過程。

圖5    RGC-32對TNF-α誘導的內(nèi)皮細胞ICAM-1和VCAM-1表達及單核細胞-內(nèi)皮細胞相互作用至關(guān)重要。

接下來，研究人員探究了 RGC-32 是否介導 TNF-α 誘導的內(nèi)皮 ICAM-1 和 VCAM-1 表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低 RGC-32 會減弱 TNF-α 誘導的啟動子活性，而 RGC-32 過表達則增強該活性（圖 5E），表明 RGC-32 在 TNF-α 誘導的內(nèi)皮 ICAM-1 和 VCAM-1 轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用。 在體外實驗中，敲低 RGC-32 可顯著抑制 TNF-α 誘導的 HUVECs 中 ICAM-1 和 VCAM-1 啟動子活性及蛋白表達（圖 5F-5G）。為了評估 RGC-32 對 ICAM-1 和 VCAM-1 表達的功能意義，研究人員將原代小鼠主動脈內(nèi)皮細胞用載體或 TNF-α 處理 24 小時，然后與 Calcein AM 標記的 THP-1 細胞共孵育，從而研究 RGC-32 是否影響單核細胞-內(nèi)皮細胞的相互作用。結(jié)果顯示，RGC-32 缺失削弱了 TNF-α 刺激下 THP-1 單核細胞與內(nèi)皮細胞的黏附（圖5H-5I），反之 RGC-32 過表達則促進兩者結(jié)合（圖5J-5K）。這些結(jié)果表明，RGC-32 介導 TNF-α 誘導的內(nèi)皮 ICAM-1 和 VCAM-1 表達，進而促進單核細胞 - 內(nèi)皮細胞的相互作用。

最后，為了驗證RGC-32 可能通過調(diào)控 NF-κB 信號通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞 ICAM-1 和 VCAM-1 的表達這一假設。研究人員使用吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（PDTC）在表達 RGC-32 的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中阻斷 NF-κB 信號。體外實驗表明，RGC-32 過表達可激活 NF-κB 磷酸化，誘導 ICAM-1 和 VCAM-1 表達，而 NF-κB 抑制劑 PDTC 可阻斷這一過程（圖 6A-6B）；反之，敲低 RGC-32 則抑制 TNF-α 誘導的 NF-κB 核轉(zhuǎn)位。免疫共沉淀證實 RGC-32 與 NF-κB 存在物理相互作用，且 TNF-α 可增強兩者結(jié)合（圖 6C-6D）。染色質(zhì)免疫沉淀實驗進一步顯示，敲低 RGC-32 減少了 TNF-α 誘導的 NF-κB 與 ICAM-1 和 VCAM-1 啟動子的結(jié)合，而過表達 RGC-32 則增加了這種結(jié)合（圖 6E-6F）。TNF-α 誘導了 RGC-32 的核轉(zhuǎn)位，使用 RGC-32 抗體的染色質(zhì)免疫沉淀實驗顯示，TNF-α 增加了 RGC-32 與 ICAM-1 和 VCAM-1 啟動子的結(jié)合（圖 6G-6H）。這些結(jié)果表明，RGC-32 直接與 NF-κB 結(jié)合并促進其與 ICAM-1 和 VCAM-1 啟動子的結(jié)合，從而在動脈粥樣硬化形成過程中促進它們的表達。

圖6    RGC-32通過NF-κB信號通路介導內(nèi)皮細胞ICAM-1和VCAM-1的表達。

總之，研究表明，RGC-32 通過促進單核細胞-EC 相互作用介導雄性動物模型中的動脈粥樣硬化生成，這是由于誘導內(nèi)皮 ICAM-1 和 VCAM-1 表達，至少部分地通過 NF-κB 信號通路。ECs 中的選擇性誘導及其促進單核細胞-EC 相互作用的作用使 RGC-32 成為動脈粥樣硬化的新型潛在治療靶點。

參考文獻：Cui XB, Luan JN, Dong K, Chen S, Wang Y, Watford WT, Chen SY. RGC-32 (Response Gene to Complement 32) Deficiency Protects Endothelial Cells From Inflammation and Attenuates Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2018 Apr;38(4):e36-e47. doi: 10.1161/ATVBAHA.117.310656. Epub 2018 Feb 15. PMID: 29449334; PMCID: PMC5864544.

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