在細胞培養(yǎng)領域，永生化人肺成纖維細胞系是一種具研究價值和應用潛力的細胞模型。而掌握其正確的操作使用方法，對于細胞的培養(yǎng)、實驗設計以及結果解讀都有著至關重要的意義。

細胞培養(yǎng)前的準備

在進行永生化人肺成纖維細胞系的培養(yǎng)之前，充分的準備工作是確保實驗順利進行的關鍵。首先，需要選擇合適的培養(yǎng)基。目前，常見的培養(yǎng)基包括 DMEM 和 RPMI 1640，這兩種培養(yǎng)基都能為細胞提供必要的營養(yǎng)物質。經實驗驗證，含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基在支持永生化人肺成纖維細胞系的生長方面表現(xiàn)出色。胎牛血清富含多種生長因子和激素，能夠促進細胞的生長和繁殖。

其次，培養(yǎng)環(huán)境的準備同樣重要。細胞培養(yǎng)需要在無菌的環(huán)境下進行，因此培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶需要經過嚴格的滅菌處理?？梢允褂酶邏簻缇佭M行物理滅菌，或者使用紫外線照射的方式對細胞培養(yǎng)箱進行消毒。培養(yǎng)箱的參數(shù)設置也至關重要，溫度應保持在 37℃，CO?濃度維持在 5% 左右，這樣的環(huán)境條件能夠模擬細胞在體內的生理環(huán)境，有利于細胞的正常生長和代謝。

細胞的復蘇操作

細胞復蘇是將凍存的細胞恢復到正常生長狀態(tài)的關鍵步驟。正確的復蘇操作可以有效提高細胞的存活率和后續(xù)的生長性能。復蘇過程中，快速解凍是關鍵。將凍存的細胞從液氮中取出后，應迅速置于 37℃水浴中，輕輕搖晃使其快速解凍。解凍后的細胞應立即用培養(yǎng)基進行稀釋，以降低凍存液中保護劑對細胞的毒性。

接下來，將細胞懸液輕輕吹打混勻后，加入適量的培養(yǎng)基，轉移到培養(yǎng)瓶中。在轉移到培養(yǎng)瓶的過程中，動作要輕柔，避免劇烈震蕩對細胞造成損傷。然后將培養(yǎng)瓶置于預先設置好的培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)。在培養(yǎng)的初期，細胞需要一個適應環(huán)境的過程，因此在最初的 24 小時內盡量減少對細胞的干擾，避免頻繁開箱觀察或移動培養(yǎng)瓶。

細胞培養(yǎng)過程中的注意事項

在細胞培養(yǎng)過程中，定期更換培養(yǎng)基是維持細胞良好生長狀態(tài)的重要措施。一般來說，每 2 - 3 天需要更換一次培養(yǎng)基，以確保細胞能夠獲得充足的營養(yǎng)物質，并及時排出代謝廢物。換液操作需要在無菌環(huán)境下進行，避免外界微生物的污染。同時，要注意觀察細胞的生長狀態(tài)，如細胞的形態(tài)、顏色以及是否有雜質等。

此外，細胞的傳代操作也是細胞培養(yǎng)中的關鍵環(huán)節(jié)。當細胞生長到一定密度時，需要進行傳代，以防止細胞因過度擁擠而出現(xiàn)生長抑制或接觸抑制現(xiàn)象。傳代時，使用合適的胰酶濃度和消化時間至關重要。胰酶濃度過高或消化時間過長會導致細胞表面蛋白受損，影響細胞的貼壁和生長；而胰酶濃度過低或消化時間過短則無法使細胞全脫離培養(yǎng)瓶壁，影響傳代效果。通常，0.25% 的胰酶消化液在 37℃下消化 1 - 2 分鐘即可使細胞順利脫落。在傳代過程中，要盡量保持細胞的完整性，避免過度吹打導致細胞破損。

細胞凍存的要點

細胞凍存是細胞保存的重要手段，正確的凍存操作可以確保細胞在長時間保存后仍能保持良好的活性和生物學特性。凍存液的配制是凍存成功的關鍵因素之一。常用的凍存液由 10% 甘油、10% DMSO 和 80% 胎牛血清混合而成。甘油和 DMSO 能夠有效降低細胞內水分的冰點，減少冰晶的形成對細胞造成的損傷；胎牛血清則為細胞提供了營養(yǎng)和保護作用。

在凍存過程中，細胞的濃度也需要進行適當?shù)恼{整。一般來說，細胞濃度應控制在 1×10? - 5×10? cells/ml 范圍內。濃度過高會導致細胞在凍存過程中因代謝廢物積累而受到毒害；濃度過低則可能使細胞在復蘇后難以形成足夠的細胞群，影響細胞的生長和繁殖。將調整好濃度的細胞懸液分裝到凍存管中，每管體積一般不超過 1 ml，以確保細胞能夠均勻受冷。

細胞計數(shù)與活力檢測

在細胞培養(yǎng)過程中，定期進行細胞計數(shù)和活力檢測是了解細胞生長狀態(tài)和健康程度的重要手段。細胞計數(shù)常用的工具是血細胞計數(shù)板。在使用血細胞計數(shù)板進行計數(shù)時，需要注意將細胞懸液充分混勻，避免細胞沉淀或聚集，以確保計數(shù)的準確性。同時，計數(shù)時要按照正確的網格區(qū)域進行統(tǒng)計，避免重復計數(shù)或遺漏。

細胞活力檢測方面，臺盼藍排斥法是一種簡單而有效的方法。臺盼藍能夠進入死細胞的細胞膜，使其染成藍色，而活細胞的細胞膜具有選擇通透性，能夠排斥臺盼藍，保持無色。通過顯微鏡觀察計數(shù)，可以快速區(qū)分活細胞和死細胞，并計算細胞的存活率。此外，MTT 法也是一種常用的細胞活力檢測方法。MTT 能夠被活細胞內的線粒體還原酶還原為藍色的結晶產物，通過比色法測定吸光度值，可以間接反映細胞的代謝活性和數(shù)量。