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藥典方案集錦丨2025 版《中國藥典》人工牛黃中膽酸類物質(zhì)分析方案
牛黃，又稱天然牛黃，為?？苿游锱５母稍锬懡Y(jié)石。是傳統(tǒng)的名貴中藥。臨床上常用于熱病神昏，中風痰迷，……，口舌生瘡，癰腫疔瘡等急難重癥。例如用于急救的安宮牛黃丸，用于清熱解毒的牛黃解毒片等中藥制劑中均含有牛黃。
來源于天然的牛黃，其產(chǎn)量低，質(zhì)量難于控制。隨著對牛黃成分、藥理、藥效研究的深入，目前天然牛黃的代用品也已經(jīng)在廣泛使用，《中國藥典》2025 版收載了人工牛黃與體外培育牛黃作為牛黃的替代品，其主要成分與天然牛黃相似。
人工牛黃，作為主要牛黃替代品，由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、牛磺酸、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工制成。所含主要成分有膽酸類、膽紅素、膽固醇、微量元素等。其中，膽酸類是其產(chǎn)生藥效的主要物質(zhì)。
關于人工牛黃中膽酸類的質(zhì)量控制 ，《中國藥典》2020 一部主要采用分光光度法測定膽酸的含量，不能夠反應人工牛黃中各種膽酸類物質(zhì)的特征和含量；有鑒于此，2025 版一部在人工牛黃 【含量測定】“膽酸類”項下，改進了膽酸類物質(zhì)的控制方法，采用了 HPLC-ELSD 方法對膽酸類物質(zhì)進行了含量測定。其中，以?；悄懰帷⑴；秦i去氧膽酸、鵝去氧膽酸和去氧膽酸作為樣品驗證系統(tǒng)適用性，理論板數(shù)以?；悄懰岱逵嫴坏陀?10000；?；悄懰崤c?；秦i去氧膽酸的分離度不小于 2.0；鵝去氧膽酸與去氧膽酸的分離度不小于 1.5。以牛磺膽酸、牛磺去氧膽酸、膽酸、甘氨膽酸、甘氨去氧膽酸和豬去氧膽酸等 6 種物質(zhì)作為對照品，控制牛黃中的膽酸類物質(zhì)含量。
為適應人工牛黃新的質(zhì)量控制要求，本文根據(jù)《中國藥典》2025 版“0512 高效液相色譜法”通則，以及人工牛黃【含量測定】“膽酸類”項下系統(tǒng)適用性下的規(guī)定，以系統(tǒng)適用性樣品評價了 HPLC 方法與快速 HPLC 方法，并建立了人工牛黃樣品中膽酸類物質(zhì)的 HPLC 與快速 HPLC 分析方法，樣品測試結(jié)果顯示快速 HPLC 方法對于人工牛黃中膽酸類物質(zhì)分離良好，相較于 HPLC 方法，分析時間大幅縮短，極大提高了分析效率。
第一部分 儀器系統(tǒng)
1260 Infinity III 600bar系統(tǒng)，1290 Infinity III ELSD 檢測器
第二部分 HPLC 分析結(jié)果
色譜條件
色譜柱：HPH-C18（250×4.6mm，4um；PN：690970-702）
流動相：A：0.2% 三氟乙酸；B：乙腈
梯度洗脫：
時間 | A（%） | B（%） |
0 | 75 | 25 |
30 | 48 | 52 |
45 | 48 | 52 |
流速：1.0mL/min
柱溫：15℃
ELSD：霧化溫度：30℃；蒸發(fā)溫度：80℃；氣體流速：1.6L/min
系統(tǒng)適用性
理論板數(shù)：以?；悄懰岱逵嫴坏陀?70000；
分離度：牛磺膽酸與?；秦i去氧膽酸分離度大于 10；鵝去氧膽酸與去氧膽酸的分離度大于 6；
系統(tǒng)適用性色譜圖：
對照品色譜圖：
人工牛黃色譜圖：
第三部分 快速 HPLC 分析結(jié)果
由于 HPLC 梯度分析時間為 45min，加上沖洗與再平衡，預計單針分析時間接近 1 小時，分析效率較低。本文選擇 Agilent Polaris 3um 色譜柱作為分離性能相當?shù)纳V柱，并根據(jù)《中國藥典》2025 版四部 “0512 高效液相色譜法”通則中規(guī)定的轉(zhuǎn)換方法對原方法參數(shù)進行了快速轉(zhuǎn)換，具體結(jié)果如下。
色譜條件
色譜柱：Polaris C18-ether（150×3mm，3um；PN：A2021150X030）
流動相：A：0.2% 三氟乙酸；B：乙腈
梯度洗脫：
時間 | A（%） | B（%） |
0 | 75 | 25 |
10.8 | 48 | 52 |
16.2 | 48 | 52 |
流速：0.7mL/min
柱溫：15℃
ELSD：霧化溫度：30℃；蒸發(fā)溫度：80℃；氣體流速：1.6L/min
系統(tǒng)適用性
理論板數(shù)：以?；悄懰岱逵嫴坏陀?50000；
分離度：?；悄懰崤c?；秦i去氧膽酸分離度大于 9；鵝去氧膽酸與去氧膽酸的分離度大于 2.5；
系統(tǒng)適用性色譜圖：
對照品色譜圖：
人工牛黃色譜圖：
結(jié)論
本文采用 1260 Infinty III 600bar 系統(tǒng)結(jié)合 1290 Infinity III ELSD，使用 HPH-C18 HPLC 重現(xiàn)了《中國藥典》2025 版 人工牛黃 【含量測定】“膽酸類”項下方法；并采用 Polaris C18 3um 色譜柱，在滿足《中國藥典》2025 四部“0512 高效液相色譜法”以及人工牛黃 【含量測定】“膽酸類”項下 系統(tǒng)適用性的要求下，并且基線分離對照品 6 種膽酸。通過合規(guī)性的方法參數(shù)轉(zhuǎn)換，建立了人工牛黃中膽酸類成分的快速分析方法。
本文人工牛黃快速 HPLC 方法與《中國藥典》2025 版人工牛黃原方法相比，分析時間從 45min 縮短至約 16min，分析效率提高約 3 倍，極大的提高了人工牛黃“膽酸類”物質(zhì)測定時的分析效率。
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