在細胞培養(yǎng)領域，永生化人骨髓間充質干細胞備受關注，因其在再生醫(yī)學、藥物篩選和疾病研究等方面展現(xiàn)出巨大潛力。為助力科研工作者高效開展相關研究，本文聚焦于永生化人骨髓間充質干細胞的操作使用，提供全面且實用的培養(yǎng)全流程管理建議。

一、細胞凍存的黃金法則

細胞凍存是細胞培養(yǎng)過程中的關鍵環(huán)節(jié)，目的是在極低溫度下保持細胞的活性和特性，以備后續(xù)使用。

（一）凍存液的精準配置

凍存液由基礎培養(yǎng)基、胎牛血清和冷凍保護劑組成，一般按照體積比 5 : 3 : 2 進行配置?；A培養(yǎng)基為細胞提供基本的營養(yǎng)成分，維持細胞的代謝活性；胎牛血清富含多種營養(yǎng)物質和細胞生長因子，有助于維持細胞的穩(wěn)定狀態(tài)；冷凍保護劑通常選用甘油或二甲基亞砜（DMSO），它們能夠降低細胞內水分的冰點，減少細胞內冰晶的形成，從而降低細胞在凍存過程中受到的損傷。

（二）凍存操作的精細流程

將細胞凍存至 - 80℃是關鍵步驟之一。首先需將細胞從培養(yǎng)皿中輕輕消化并制成細胞懸液，用凍存液按合適的比例進行稀釋，將細胞濃度調整至 1×10^6 - 5×10^6 個 / mL。將混合后的細胞懸液分裝至凍存管中，每管裝液量約為 1 - 1.5 mL。隨后，將凍存管置于 - 80℃的冰箱中，一般需要經過 24 - 48 小時的冷凍過程，使細胞充分適應低溫環(huán)境，降低代謝速度，同時減少細胞內水分的冰晶形成，從而降低細胞受到的凍存損傷。

二、細胞復蘇的細膩操作

細胞復蘇是將凍存的細胞快速恢復到常溫并重新進入生長狀態(tài)的過程，操作的精細程度直接關系到細胞的復蘇成功率和活性。

（一）溫度的精準調整

從 - 80℃取出凍存管后，需立即將其放入 37℃的水浴中快速解凍。水浴的溫度要嚴格控制，過高會導致細胞受熱不均，引起細胞膜結構的破壞；過低則會使解凍速度過慢，細胞內部形成冰晶，損傷細胞內的細胞器?？焖俳鈨瞿艽_保細胞內外溫度均衡上升，減少細胞內冰晶的生成和細胞的損傷，使細胞在短時間內恢復到正常狀態(tài)。

（二）適應性培養(yǎng)的細致安排

解凍后的細胞經過離心去除凍存液后，要用新鮮培養(yǎng)基進行重懸，然后置于細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)箱的溫度、濕度和氣體環(huán)境要精確調節(jié)，一般溫度為 37℃，濕度保持在 95% 以上，氣體環(huán)境為 5% 二氧化碳和 95% 空氣。細胞在復蘇后的最初 24 - 48 小時內，生長狀態(tài)較為脆弱，需要密切觀察細胞的形態(tài)和生長情況，必要時更換培養(yǎng)基，以確保細胞順利適應培養(yǎng)環(huán)境，恢復正常的生長代謝。

三、細胞污染的防治要訣

細胞污染是細胞培養(yǎng)中的常見問題，它會嚴重影響細胞的生長和實驗結果的準確性，因此預防和處理細胞污染至關重要。

（一）培養(yǎng)環(huán)境的嚴格維護

細胞培養(yǎng)環(huán)境包括培養(yǎng)箱、超凈工作臺和培養(yǎng)基等。培養(yǎng)箱要定期進行清潔和消毒，去除內部的灰塵和細菌，一般每兩周使用 75% 的酒精擦拭培養(yǎng)箱內壁，并開啟培養(yǎng)箱的高溫滅菌功能進行滅菌。超凈工作臺在使用前要提前開啟，讓其運行一段時間，以凈化空氣，確保在細胞操作過程中有一個無菌的環(huán)境。培養(yǎng)基則要嚴格控制保存條件，一般在 4℃保存，且在有效期內使用，避免培養(yǎng)基被污染或變質，從而降低細胞污染的風險。

（二）操作人員的衛(wèi)生管理

操作人員是細胞培養(yǎng)過程中的潛在污染源之一，因此要重視個人衛(wèi)生和操作規(guī)范。在進行細胞操作前，要洗凈雙手，并戴上無菌手套，避免手上的細菌和微生物接觸到細胞或培養(yǎng)基。同時，要穿著干凈的實驗服，佩戴口罩和帽子，防止頭發(fā)和口鼻中的微生物污染細胞。操作過程中，動作要輕柔、迅速，減少細胞暴露在外界環(huán)境中的時間，降低細胞受到污染的可能性。

（三）抗生素使用的策略

合理使用抗生素是防止細胞污染的有效輔助手段。在細胞培養(yǎng)初期，可以在培養(yǎng)基中加入適量的青霉素 - 鏈霉素溶液，一般濃度為 100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素。這兩種抗生素能夠有效抑制革蘭氏陽性和陰性細菌的生長，但長期使用可能使細胞產生耐藥性，或對細胞的生長產生一定的抑制作用。因此，在細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定后，應逐漸降低或停止使用抗生素，以確保細胞在正常生理環(huán)境下的生長。