結直腸癌（CRC）是成本最高的健康問題之一，在發(fā)達國家癌癥相關死亡率中第二。轉移性 CRC 的預后較差，5 年生存率低于 15%。因此，發(fā)現(xiàn)能夠實現(xiàn) CRC 早期診斷、準確預后和個性化治療的分子標志物極為重要，這仍是該領域的一項挑戰(zhàn)。許多蛋白質(zhì)已被確定為具有臨床價值的潛在生物標志物，它們幾乎是所有細胞功能的直接執(zhí)行者。此外，蛋白質(zhì)的顯著多樣性因眾多翻譯后修飾（PTM）而增加，這些修飾可以快速、可逆地響應環(huán)境或細胞內(nèi)刺激，最終將成為有價值的生物標志物候選資源。目前，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學能夠同時檢測數(shù)千種蛋白質(zhì)及其表達變化，從而在疾病等特定條件下提供蛋白質(zhì)組多樣性的全局圖景。

結直腸癌發(fā)展過程

PTM 是對特定氨基酸的化學修飾，可調(diào)節(jié)大多數(shù)真核蛋白質(zhì)的構象、活性、相互作用、穩(wěn)定性和空間分布，從而作為快速且可逆的開關，以一種非常 “經(jīng)濟高效” 的方式執(zhí)行調(diào)節(jié)功能。磷酸化作為細胞周期、生長、凋亡和信號轉導途徑的主要調(diào)節(jié)因子就是一個例證。越來越多的證據(jù)表明，異常的 PTM 事件與多種人類疾病有關。事實上，磷酸化、糖基化、乙?；?、泛素化、甲基化和瓜氨酸化等 PTM 已被證明在 CRC 的發(fā)生、發(fā)展和轉移中發(fā)揮作用，因此強調(diào)了對 PTM 進行全局分析以發(fā)現(xiàn)具有生物學和治療潛力的靶點的必要性。

Summary of important PTM events and their involved pathways in CRC

由于蛋白質(zhì)組中的大多數(shù) PTM 豐度較低且亞化學計量，在沒有預先富集的情況下，無法有效檢測或定量測量。一般來說，用于全局 PTM 分析方法的富集技術根據(jù)所涉及的化學原理可分為兩類：共價標記以及感興趣的 PTM 與其選擇性探針之間的非共價相互作用。針對每種類型的 PTM，已經(jīng)開發(fā)了基于這兩種化學類型之一的不同富集策略。隨后，對富集的 PTM 進行蛋白質(zhì)組學分析，可以使用質(zhì)譜（MS）解析母離子的特定質(zhì)量位移和子離子的質(zhì)量特征。

磷酸化

蛋白質(zhì)磷酸化通常發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上，是最常見的 PTM 之一，通常作為眾多蛋白質(zhì)功能的分子開關，負責信號通路的許多關鍵功能。在 CRC 中，大量異常磷酸化與細胞周期依賴性激酶家族蛋白、凋亡調(diào)節(jié)蛋白、生長因子受體及其下游信號分子密切相關。因此，驅動 CRC 腫瘤發(fā)生和發(fā)展的磷酸化蛋白質(zhì)是用于早期診斷、化療耐藥和個體化治療的有價值的生物標志物。傳統(tǒng)的基于抗體的方法，如蛋白質(zhì)免疫印跡（western blotting）、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和免疫組織化學，旨在檢測單個磷酸化蛋白質(zhì)，但無法對蛋白質(zhì)磷酸化進行全局分析或識別磷酸化位點。在基于 MS 的蛋白質(zhì)組學時代，磷酸肽富集和數(shù)據(jù)采集方面的方法學成果不斷取得進展，使得對參與腫瘤發(fā)生和 CRC 發(fā)展的復雜信號通路進行磷酸化蛋白質(zhì)組分析成為可能。

由于磷酸化蛋白質(zhì)的亞化學計量和低豐度，在質(zhì)譜分析之前，需要對磷酸化肽進行富集和分離。常用的富集方法包括金屬氧化物親和色譜（MOAC）、固定化金屬離子親和色譜（IMAC）、免疫親和富集和基于結構域的富集。MOAC 和 IMAC 常用于絲氨酸 / 蘇氨酸磷酸化的富集。SIMAC（IMAC 和 MAOC 的組合）進一步提高了磷酸肽的富集效率，能夠對微量樣品中的全局磷酸化蛋白質(zhì)進行深入分析。由于酪氨酸磷酸化肽約占磷酸肽的 1%，IMAC 和 MOAC 等方法對酪氨酸磷酸化肽的富集效果不佳。相反，一種基于抗體免疫親和的策略已經(jīng)被開發(fā)出來，能夠特異性富集酪氨酸磷酸化肽。此外，受體酪氨酸激酶（RTK）的底物，如 SH2 結構域，也可用于富集含有 SH2 相互作用結構域的酪氨酸磷酸肽。除了在富集技術上的努力，許多研究還致力于在質(zhì)譜分析之前通過進一步分離來降低富集的磷酸肽的復雜性。常見的分離策略包括強陽離子交換色譜（SCX）、強陰離子交換色譜（SAX）、親水相互作用液相色譜（HILIC）和靜電排斥親水相互作用色譜（ERLIC）。SCX 和 SAX 均基于磷酸肽的電荷分離，而 HILIC 根據(jù)磷酸肽的親水性進行分離。ERLIC 通過親水相互作用和靜電排斥將磷酸化肽與非磷酸化肽分離。隨后，富集的磷酸肽可以通過質(zhì)譜結合成熟的同位素標記技術（如 SILAC、iTRAQ 和 TMT）進行鑒定或定量

Schematic process for phosphopeptides enrichment and subsequent fractionation in MS-based phosphoproteomic analysis

特定信號分子的磷酸化網(wǎng)絡是 CRC 復發(fā)和轉移的有價值的生物標志物。基于磷酸化蛋白質(zhì)組生物標志物的復發(fā)風險分層有助于在輔助化療中進行減法操作，以減少毒副作用和第二原發(fā)性腫瘤的風險。臨床數(shù)據(jù)證實，低風險的 II 期 CRC 患者無法從輔助化療中獲益，而在低風險的 III 期 CRC 患者中，3 個月的輔助化療并不遜色于 6 個月的輔助化療。比較磷酸化蛋白質(zhì)組學研究表明，SW480 細胞中細胞周期蛋白依賴性激酶 2（CDK2）在 Tyr15 位點的磷酸化水平比 SW620 細胞高 3.3 倍。因此，臨床患者隊列數(shù)據(jù)顯示，CDK2 在 Tyr15 位點的磷酸化是低復發(fā)風險的生物標志物。在不久的將來，Tyr15 位點磷酸化 CDK2 水平較高的 II 期 CRC 患者可能無需輔助化療即可安全管理。手術切除是治療肝轉移有效的治療方法，估計 5 年生存率為 50%；然而，只有約 25% 的患者符合手術切除條件。轉移的早期診斷可以提高轉移性 CRC 的（R0）切除率和預后，目前迫切需要經(jīng)過驗證的生物標志物。一項針對中國 CRC 患者隊列的綜合組學研究表明，基于原發(fā)性腫瘤的磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)可以區(qū)分轉移性和非轉移性 CRC。轉移性 CRC 的磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的顯著特征是 MHC1 中磷酸化位點的下調(diào)以及 mTOR 信號通路和糖酵解途徑中磷酸化位點的上調(diào)，這些可能是轉移性 CRC 的潛在診斷生物標志物和潛在治療靶點。參與抗原加工和呈遞途徑的 MHC1 的磷酸化有可能成為抗腫瘤免疫治療的生物標志物和靶點。

KRAS 突變是預后不良和對抗 EGFR 治療耐藥的重要預測生物標志物，常見于 KRAS 基因外顯子 2 的密碼子 12（G12D）和 13（G13D）。然而，不同的 KRAS 突變似乎與不同的臨床病理特征和對抗 EGFR 治療的不同藥物敏感性相關，這表明不同的 KRAS 突變會導致不同信號通路的激活。Raish 等人利用基于免疫親和富集的磷酸化蛋白質(zhì)組學揭示了 KRAS G12D 和 G13D 等位基因的磷酸酪氨酸特征。結果表明，兩種 KRAS 突變存在不同的信號通路和代謝重編程模式。髓鞘蛋白零樣 1（MPZL1）蛋白在 Tyr263 位點的過度磷酸化是 G12D 突變下游的一個新分子，敲低 MPZL1 與對 EGFR 抑制的敏感性增加有關。因此，MPZL1 可能作為 KRAS G12D 的生物標志物和潛在治療靶點。研究人員越來越多地利用磷酸化蛋白質(zhì)組學探索新的生物標志物，為攜帶 KRAS 突變的 CRC 提供更個性化的治療選擇。

抗表皮生長因子受體（anti-EGFR）單克隆抗體，如西妥昔單抗和帕尼單抗，是治療 KRAS 野生型轉移性 CRC（mCRC）的基石。然而，50% 的 RAS 野生型 CRC 患者對西妥昔單抗耐藥，且目前仍缺乏經(jīng)過驗證的西妥昔單抗耐藥生物標志物。西妥昔單抗耐藥細胞的磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)顯示，SRC-PRKCD 途徑顯著激活，SRC 抑制劑可逆轉西妥昔單抗耐藥。在 SRC 過表達的結直腸癌細胞中，酪氨酸磷酸化網(wǎng)絡顯示 SRC 與其他酪氨酸激酶途徑（如 MET、EphA2 和 SGK223）之間存在廣泛的相互作用?；?MS 的磷酸化蛋白質(zhì)組學構建的 HGF-MET 信號網(wǎng)絡表明，MET 和 SRC 信號之間存在許多連接節(jié)點。因此，EGFR 下游途徑的激活可能被視為抗 EGFR 單克隆抗體耐藥的關鍵生物標志物，也是逆轉 CRC 中抗 EGFR 治療耐藥的有效治療靶點。

總之，蛋白質(zhì)磷酸化是 CRC 中用于術后復發(fā)風險分層和轉移性 CRC 個體化治療的重要生物標志物。然而，目前大多數(shù)關于磷酸化蛋白質(zhì)組學生物標志物的研究受樣本量小的限制，仍處于臨床前階段。目前基于 MS 的 CRC 磷酸化蛋白質(zhì)組學研究已整理在表 1 中。顯然，迫切需要對磷酸化蛋白質(zhì)組學進行更大規(guī)模的前瞻性隊列研究，以及方法學優(yōu)化和成本降低，以促進其在臨床實踐中的應用。

乙酰化

賴氨酸乙?；腿ヒ阴；莿討B(tài)且可逆的 PTM，其中乙酰基轉移到賴氨酸殘基的 ε- 氨基上。乙酰化的動態(tài)平衡由賴氨酸乙酰轉移酶（KATs，也稱為組蛋白乙酰轉移酶）和賴氨酸去乙?；福↘DACs，也稱為組蛋白去乙?；福┱{(diào)節(jié)。50 多年前在組蛋白中描述的賴氨酸殘基乙?；?，會導致賴氨酸殘基的正電荷中和，誘導染色質(zhì)結構松散和轉錄激活。除組蛋白外，乙?；揎椧泊嬖谟诜墙M蛋白蛋白質(zhì)中，并廣泛參與信號轉導、細胞周期、染色質(zhì)重塑、DNA 修復和復制、RNA 剪接、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和運輸以及轉錄調(diào)控。越來越多的數(shù)據(jù)表明，乙?；c腫瘤發(fā)生和癌癥進展密切相關。組蛋白乙?；瘜е掳┗蚝鸵职┗虻霓D錄活性異常，而非組蛋白乙?；瘜е麓侔┮蜃雍鸵职┮蜃拥姆€(wěn)定性和活性改變。因此，組蛋白和非組蛋白蛋白質(zhì)的乙?；悄[瘤發(fā)生和進展的關鍵生物標志物，也是治療干預的潛在靶點。高分辨率質(zhì)譜結合液相色譜以擴大乙?；臋z測范圍，將加深我們對乙?；诎┌Y中作用的理解，并促進乙?；律飿酥疚锏陌l(fā)現(xiàn)。

基于 MS 的自下而上蛋白質(zhì)組學已成為蛋白質(zhì)乙?；臀稽c鑒定的主要方法。蛋白質(zhì)乙酰化分析的主要挑戰(zhàn)是乙?；鞍踪|(zhì)的化學計量比和豐度較低。因此，乙?；牡母患头蛛x是蛋白質(zhì)乙?；b定和定量的關鍵步驟。使用抗乙?；嚢彼峥贵w進行免疫親和純化富集可提高乙酰化 MS 分析的深度。SCX 是常用的分離策略，通常與免疫親和純化富集相結合。

越來越多的證據(jù)表明，組蛋白乙酰化的失調(diào)與結直腸癌的發(fā)生和預后密切相關，涉及多種失調(diào)的酶，包括 KATs 和 KDACs。對結直腸癌樣本和配對正常黏膜樣本中組蛋白 PTM 的基于 MS 的分析表明，CRC 中組蛋白 H3 賴氨酸 27（H3K27ac）的乙酰化顯著增加。一些報告表明，全局組蛋白乙?；墙Y直腸癌晚期、淋巴結轉移、預后不良和高復發(fā)風險的生物標志物。原發(fā)性結直腸癌組織和肝轉移組織中乙酰化組蛋白的蛋白質(zhì)組學研究，描述了原發(fā)性腫瘤和轉移組織中乙?；M蛋白的不同表達，結果顯示肝轉移中乙?；M蛋白 H3/H2 在 Lys 19 和 H2B 在 Lys 121 處的變化最大。然而，一些特定乙?；M蛋白的表達增加與良好的預后相關，例如，H3K12ac 和 H3K18ac 是組織學亞型分化較好的生物標志物，H3K56ac 和 H4K16ac 是復發(fā)風險較低和生存期較長的生物標志物。進一步明確組蛋白乙?；捌湎掠伟谢蛟?CRC 腫瘤發(fā)生和轉移中的作用，將有助于深入理解組蛋白乙?；诎┌Y生物學中的意義。

非組蛋白乙?；?CRC 中也起著至關重要的作用，例如在 p53 中。基于 MS 的非組蛋白蛋白質(zhì)乙?；鞍踪|(zhì)組學表明，IDH1 K224 在轉移部位的乙酰化水平顯著增加，高水平的乙酰化 IDH1 與 CRC 中的晚期腫瘤、肝轉移和生存率降低顯著相關。因此，IDH1 乙酰化是 CRC 有前景的生物標志物和未來的治療靶點?；?MS 的 EGFR 的 PTM 鑒定出人類 CRC 細胞中 EGFR 的一種新修飾，K1037 乙?；?，由上游抗氧化多功能酶硫氧還蛋白（SRX）調(diào)節(jié)，它抑制 EGFR 磷酸化和激活。EGFR 的 PTM 與 EGFR 途徑的激活和抗 EGFR 治療的療效密切相關，這是逆轉西妥昔單抗耐藥的一個有前景的方向。

組蛋白和非組蛋白蛋白質(zhì)的乙?；?CRC 的重要生物標志物，靶向乙?；寞煼?，如組蛋白去乙?；敢种苿℉DACis），在臨床前研究中已顯示出在結直腸癌治療中的良好應用潛力。然而，關于基于 MS 的結直腸癌全局乙?；治龅奈墨I仍然稀少，迫切需要在結直腸癌的分子生物學研究中更廣泛地應用先進的特定蛋白質(zhì)組學方法來研究乙?；?/span>

糖基化

糖基化是最常見的翻譯后修飾之一，包括兩種主要類型的糖基化：發(fā)生在天冬酰胺殘基上的 N - 糖基化和發(fā)生在絲氨酸或蘇氨酸氨基酸殘基上的 O - 糖基化。這是一個在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和高爾基體中進行的多步酶促過程，參與信號轉導、免疫反應和癌癥相關生物學等多個生物學過程。糖基化事件以及糖基化相關酶系統(tǒng)的失衡與多種病理狀況（如癌癥）相關，在診斷和治療的生物標志物中起著至關重要的作用。在結直腸癌中，生長因子受體（如 EGFR）的糖基化會改變藥物 - 受體相互作用，可能是抗 EGFR 治療耐藥的潛在生物標志物，而參與糖基化的 N - 乙酰葡糖胺轉移酶 V 與腫瘤發(fā)生和轉移相關，可能是診斷和預后的潛在生物標志物?；谫|(zhì)譜的糖蛋白質(zhì)組學系統(tǒng)地表征糖蛋白的糖基化位點和聚糖結構，有助于我們理解糖基化在結直腸癌腫瘤發(fā)生和進展中的生物學作用，并發(fā)現(xiàn)用于診斷和治療的生物標志物。

糖基化肽的富集是蛋白質(zhì)糖基化全局分析的關鍵步驟。傳統(tǒng)的富集策略包括凝集素親和色譜和酰化化學富集，這些方法通過去除糖鏈結構進行簡化，也稱為去糖蛋白質(zhì)組學，但缺乏關于聚糖的重要信息。隨著基于 MS 的糖蛋白質(zhì)組學富集策略和技術的進步，糖型和糖基化位點正成為糖基化鑒定的主要目標。新的策略包括同位素靶向糖蛋白質(zhì)組學（IsoTaG）、N - 連接聚糖和含糖基化位點肽的固相萃?。∟GAG）以及基于硼酸的化學富集。IsoTaG 能夠在全蛋白質(zhì)組水平表征完整的、代謝標記的糖肽，但僅限于培養(yǎng)細胞樣本。NGAG 能夠表征單個糖基化位點的聚糖異質(zhì)性，用于系統(tǒng)地表征 N - 糖蛋白質(zhì)組。Yang 及其同事開發(fā)了一種基于硼酸修飾的介孔磁性顆粒的多模態(tài)材料，在富集微量樣本中的糖肽方面非常有效?；?MS 的蛋白質(zhì)糖基化測定的另一個技術問題是糖基化后沒有恒定的質(zhì)量位移。因此，需要建立糖基化的質(zhì)量標簽，以便使用 MS 識別糖基化位點。N - 糖基化的質(zhì)量標簽通常由 PNGase F 水解或化學去糖基化產(chǎn)生，而 O - 糖基化的質(zhì)量標簽由 β-elimination產(chǎn)生。

Enrichment strategies and mass tags for glycoproteomics.

癌細胞分泌的糖蛋白和位于細胞膜表面的糖蛋白是結直腸癌早期診斷的關鍵線索。糖蛋白質(zhì)組學鑒定了結直腸癌中糖蛋白的差異表達，發(fā)現(xiàn)如ICAM1、APMAP、Annexin 4、Annexin 5、Annexin A1和CLCA1等膜結合糖蛋白是結直腸癌診斷的敏感且特異的生物標志物，這些標志物需要在血漿[86–89]中驗證。來自血漿中與癌癥相關的外顯子的FGB）和β2-GP1在結直腸癌的診斷中比CA199具有更高的靈敏度和特異性。結直腸癌細胞的外囊泡糖蛋白質(zhì)組學顯示，轉移細胞中的O-GlcN 蛋白水平高于非轉移細胞。O-GlcN 的胞外囊泡蛋白可能在腫瘤細胞中傳遞距離信息的功能，并可成為結直腸癌轉移的潛在生物標志物。綜上，糖基化蛋白是結直腸癌的重要生物標志物，而糖基化免疫球蛋白可能是結直腸癌免疫治療的潛在生物標志物和潛在靶點。

總結

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學發(fā)現(xiàn)大量具有 CRC 診斷或治療潛力的蛋白質(zhì)靶點，多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM）及修飾位點被發(fā)現(xiàn)與 CRC 發(fā)生、發(fā)展和干預的分子機制密切相關。

• PTM 研究范圍與方法：目前關于 CRC 中 PTM 的研究多集中在磷酸化、乙?；吞腔壬贁?shù)幾種，而其他 PTM（如甲基化、泛素化、瓜氨酸化）作用漸顯，需系統(tǒng)探索更多 PTM 的功能機制，且當前富集策略和質(zhì)譜方法有待改進以全面分析每種 PTM。

• PTM 間的相互作用：盡管對多種 PTM 在生物過程中的研究增多，但 PTM 間的串擾（多種 PTM 的協(xié)調(diào)）未得到充分關注，雖已發(fā)現(xiàn)一些 CRC 中 PTM 串擾的證據(jù)（如 PRMTs 和 EGFR 相關的 PTM 串擾），但還需進一步功能測定來研究其相互作用。

• 臨床轉化：大量臨床研究已鑒定出數(shù)千種與疾病相關的 PTM，但其臨床轉化不成熟，作為生物標志物的重要性缺乏大規(guī)模臨床試驗驗證，檢測和富集這些 PTM 的抗體匱乏阻礙了常規(guī)臨床技術應用，研究人員嘗試探索質(zhì)譜（MS）在臨床的應用，雖 MS 尚未成為臨床診斷常規(guī)工具，但有望成為測量具有臨床潛力的翻譯后修飾肽和蛋白質(zhì)的有力手段 。

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