2024年5月，上海尋百匯生物科技有限公司團(tuán)隊(duì)在《Cell》（IF：42.5）發(fā)表了題為IGSF8 is an innate immune checkpoint and cancer immunotherapy target的研究文章。該研究利用CRISPR技術(shù)，篩選出IGSF8為NK細(xì)胞檢查點(diǎn)，它通過與NK細(xì)胞表面KIR3DL2受體的特異性相互作用來抑制NK細(xì)胞功能。單獨(dú)使用抗體阻斷IGSF8或聯(lián)合抗PD1治療可以顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，證明IGSF8是一個(gè)天然免疫檢查點(diǎn)及癌癥免疫治療靶點(diǎn)。

作者提出假說：MHC-I缺陷的惡性細(xì)胞通過表達(dá)特定蛋白來抑制NK細(xì)胞功能，從而逃避免疫清除。為系統(tǒng)鑒定具有NK細(xì)胞檢查點(diǎn)功能的蛋白分子，研究人員分別在MHC-I表達(dá)正常的COLO205人結(jié)腸癌細(xì)胞系和MHC-I缺陷的AGS人胃癌細(xì)胞系中建立了NK細(xì)胞共培養(yǎng)CRISPR篩選體系。通過慢病毒感染兩種細(xì)胞（COLO205是全基因組敲除文庫(kù)，而AGS細(xì)胞是細(xì)胞表面蛋白編碼基因敲除文庫(kù)），單獨(dú)或者與人原代NK細(xì)胞共培養(yǎng)過夜（圖1A）。

▲圖1 Identification of IGSF8 as a suppressor of NK cell killing

通過高通量測(cè)序分析編輯后的COLO205和AGS細(xì)胞在NK細(xì)胞處理前后的sgRNA豐度變化，并采用MAGeCK算法鑒定兩組間差異選擇的基因。研究人員對(duì)負(fù)向選擇基因（即敲除后使惡性細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷更敏感的基因）進(jìn)行了研究，并確實(shí)發(fā)現(xiàn)了許多已知能抑制NK細(xì)胞殺傷作用的基因。例如，在COLO205細(xì)胞中，MHC-I分子（包括與KIR2D家族受體結(jié)合的HLA-C、與NKG2A結(jié)合的HLA-E）是*顯著的負(fù)向選擇基因（圖1B）；兩株細(xì)胞共有的其他負(fù)向選擇基因，如EPCAM、CD38、PVR。兩株細(xì)胞中正向選擇基因共同包含了已知的NK細(xì)胞活化配體：COLO205中顯著富集的是NCR3LG1（又稱B7-H6）；AGS中則是ICAM1、MICA/B和CD58（圖1C）。這一結(jié)果支持了所用方法的可靠性，并驗(yàn)證了NK細(xì)胞共培養(yǎng)CRISPR篩選實(shí)驗(yàn)的有效性。同時(shí)，研究人員也發(fā)現(xiàn)了IGSF8在兩項(xiàng)篩選中均持續(xù)表現(xiàn)為強(qiáng)負(fù)向選擇基因（圖1B）。研究人員在COLO205和AGS細(xì)胞系中敲除IGSF8，與NK細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞的殺傷效率顯著提升（圖1D、1E）。IGSF8是一個(gè)進(jìn)化上保守的基因，人與小鼠之間的序列一致性達(dá)90%。研究人員敲除B16-F10中的Igsf8，觀察到NK細(xì)胞殺傷顯著增強(qiáng)（圖1F和1G），這表明IGSF8對(duì)NK細(xì)胞的抑制在人與小鼠之間是保守的。Igsf8敲除對(duì)B16-F10細(xì)胞的體外生長(zhǎng)影響很小，但它顯著降低了C57BL/6同源小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)（圖1H）。對(duì)腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D45+細(xì)胞的流式分析顯示，B16-F10中Igsf8敲除導(dǎo)致NK細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞顯著增加，而對(duì)巨噬細(xì)胞影響很?。▓D1I）。比較移植17天后有或無(wú)Igsf8敲除的B16-F10腫瘤的RNA-seq圖譜發(fā)現(xiàn)，腫瘤中Igsf8敲除導(dǎo)致NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性顯著上調(diào)，抗原加工呈遞和T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)增加（圖1J）。以上結(jié)果表明IGSF8是一種NK細(xì)胞檢查點(diǎn)和新的免疫治療靶點(diǎn)。

IGSF8蛋白通常與外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中的靜息NK細(xì)胞相互作用較弱，但在CRISPR篩選中使用的擴(kuò)增NK細(xì)胞，這種相互作用顯著增強(qiáng)（圖2A和2B）。研究人員分選了與IGSF8蛋白結(jié)合能力處于
*低10%和最高90%的擴(kuò)增NK細(xì)胞，通過比較這兩個(gè)細(xì)胞群體的RNA-seq圖譜，發(fā)現(xiàn)KIR3DL2是差異表達(dá)*顯著的細(xì)胞表面受體（圖2C）。在表達(dá)六種不同KIR家族成員的Fc融合蛋白實(shí)驗(yàn)中，僅KIR3DL2能與過表達(dá)IGSF8的小鼠CT26細(xì)胞結(jié)合（圖2D）。擴(kuò)增后的NK細(xì)胞中KIR3DL2表達(dá)顯著增加（圖2E），這與IGSF8蛋白對(duì)這些細(xì)胞結(jié)合增強(qiáng)的現(xiàn)象一致（圖2B）。在九名不同供體的擴(kuò)增NK細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，研究人員觀察到KIR3DL2表達(dá)水平與IGSF8結(jié)合強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)（圖2F）。這些結(jié)果共同證實(shí)了IGSF8與人NK細(xì)胞表面KIR3DL2受體之間存在特異性相互作用。

將擴(kuò)增的原代NK細(xì)胞與過表達(dá)IGSF8、HLA-C或HA標(biāo)簽對(duì)照的K562細(xì)胞共孵育，檢測(cè)NK細(xì)胞脫顆粒水平。結(jié)果顯示，K562-HLA-C能普遍抑制NK細(xì)胞的脫顆粒（無(wú)論KIR3DL2表達(dá)水平如何），而K562-IGSF8僅特異性抑制KIR3DL2+ NK細(xì)胞的脫顆粒（圖2G）。使用類似的方法，研究人員發(fā)現(xiàn)Ly49家族中的Klra9 mRNA在結(jié)合Igsf8蛋白的NK細(xì)胞中顯著富集（圖2H），只有Klra9蛋白能特異性結(jié)合CT26-Igsf8細(xì)胞（圖2I）。

▲圖2 Identification of KIR3DL2 and Klra9 as the binding partner of IGSF8 on NK cells

通過對(duì)96項(xiàng)研究的腫瘤單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)分析，研究人員進(jìn)一步證實(shí)IGSF8在惡性細(xì)胞中表達(dá)水平最高（圖3B）。相比之下，KIR3DL2在TCGA癌癥樣本中總體表達(dá)量較低且拷貝數(shù)變異稀少，但特異性地表達(dá)于NK細(xì)胞和T細(xì)胞（圖3B）。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析的腫瘤中，IGSF8 mRNA表達(dá)與CD8、顆粒酶、穿孔素、CD274（PDL1）以及MHC-I成員B2M呈負(fù)相關(guān)（圖3C）。與癌旁正常上皮細(xì)胞相比，惡性細(xì)胞（特別是MMRp腫瘤）表現(xiàn)出B2M表達(dá)顯著降低和IGSF8表達(dá)升高（圖3D）。更重要的是，我們?cè)谕荒[瘤樣本的不同惡性細(xì)胞中觀察到MHC-I與IGSF8蛋白呈現(xiàn)異質(zhì)性且互斥的表達(dá)模式（圖3E）。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌和黑色素瘤中，MHC-I低表達(dá)腫瘤群體內(nèi)，高IGSF8表達(dá)與更差的生存率顯著相關(guān)（圖3F）。另一項(xiàng)抗PD-1治療前后黑色素瘤樣本的研究表明，治療有效組的腫瘤組織IGSF8水平顯著降低（圖3G）。以上結(jié)果說明，IGSF8在多種癌癥中呈現(xiàn)高表達(dá)并與不良臨床預(yù)后相關(guān)。

▲圖3 Evaluation of IGSF8 and KIR3DL2 gene expression profiles in patient tumors

研究人員開發(fā)了一種靶向IGSF8的抗體（IGSF8.06）用于阻斷IGSF8與其結(jié)合配體的相互作用。該抗體與人類IGSF8具有高親和力（圖4A）。該抗體可特異性阻斷KIR3DL2與過表達(dá)人源IGSF8的CT26細(xì)胞結(jié)合（圖4B），以及Klra9與過表達(dá)小鼠Igsf8的CT26細(xì)胞結(jié)合（圖4C）。Fc沉默型IGSF8.06抗體還能提升PBMC來源NK細(xì)胞對(duì)過表達(dá)IGSF8的K562細(xì)胞的殺傷效率（圖4D）。隨后，研究人員檢測(cè)了武漢尚恩生物的原代肺癌、結(jié)腸癌和肝癌惡性細(xì)胞（這些細(xì)胞均具有可檢測(cè)的IGSF8和MHC-I表達(dá)），發(fā)現(xiàn)IGSF8.06處理同樣能增強(qiáng)PBMC來源NK細(xì)胞對(duì)這些惡性細(xì)胞的殺傷（圖4E-4G）。為探究IGSF8.06抗體激活NK細(xì)胞的作用是否依賴KIR3DL2，研究人員在COLO205或K562-IGSF8惡性細(xì)胞與NK92/NK92-KIR3DL2細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中測(cè)試了該抗體。結(jié)果顯示：IGSF8.06抗體能顯著增強(qiáng)NK92-KIR3DL2細(xì)胞對(duì)COLO205和K562-IGSF8細(xì)胞的殺傷，但對(duì)野生型NK92細(xì)胞的殺傷能力無(wú)影響（圖4H）。此外，該抗體顯著提高了表達(dá)Klra9的小鼠脾臟來源擴(kuò)增NK細(xì)胞對(duì)黑色素瘤B16-F10細(xì)胞的細(xì)胞毒性（圖4I）。這些結(jié)果共同證明，IGSF8.06抗體通過阻斷IGSF8與其NK細(xì)胞受體的相互作用來增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)惡性細(xì)胞的殺傷能力。

▲圖4 Development of an anti-IGSF8 antibody to activate NK cell-mediated cytotoxicity

研究人員在B16-F10同源腫瘤模型中評(píng)估了Fc沉默型IGSF8.06抗體的體內(nèi)療效，發(fā)現(xiàn)使用抗體后腫瘤增長(zhǎng)受到顯著抑制 (圖5A)。對(duì)腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D45+細(xì)胞的流式分析顯示，IGSF8.06治療顯著增加了NK細(xì)胞、T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC）的浸潤(rùn)，但對(duì)巨噬細(xì)胞影響甚微（圖5B）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，雖然使用抗CD4或CD8b抗體清除CD4/CD8 T細(xì)胞僅適度影響IGSF8.06抗體的體內(nèi)療效（圖5C），但用抗NK1.1抗體清除NK細(xì)胞則完*消除了其治療效果（圖5D）。由于該抗體在小鼠體內(nèi)不具備Fc介導(dǎo)的效應(yīng)功能,這些結(jié)果表明IGSF8.06抗體通過阻斷作用激活NK細(xì)胞是其產(chǎn)生體內(nèi)抗腫瘤活性的關(guān)鍵機(jī)制。我們進(jìn)一步評(píng)估了IGSF8.06抗體作為單藥或聯(lián)合抗PD1治療在黑色素瘤（B16-F10）、Lewis肺癌（LLC）、結(jié)腸癌（CT26）和三陰性乳腺癌（EMT6）同源腫瘤模型中的體內(nèi)療效。在所有模型中，IGSF8.06單藥治療均展現(xiàn)出顯著的體內(nèi)抗腫瘤活性（圖5E），并且顯著提升小鼠的生存率（圖5F）。

▲圖5 Igsf8 blockade by IGSF8.06 promotes anti-tumor immunity in vivo