【摘要】  目的 了解ELISA在干、濕孵育條件下的試驗(yàn)結(jié)果。方法 設(shè)定4種干、濕孵育條件，以雙抗體夾心法測(cè)定不同濃度HBsAg血清樣品OD值。結(jié)果 結(jié)果顯示HBsAg濃度較高時(shí)，在不同孵育條件下，OD值差異不大，濃度較低時(shí)則有明顯區(qū)別。結(jié)論 ELISA在濕孵育條件結(jié)果更可靠。

【關(guān)鍵詞】  ELISA;濕孵育條件;OD值

ELISA因其結(jié)果穩(wěn)定、實(shí)驗(yàn)條件相對(duì)要求較低，廣泛應(yīng)用于多種血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)，在基層實(shí)驗(yàn)室普及很廣。目前市售試劑盒配置齊全，只要操作人員加樣準(zhǔn)確，按試劑盒要求操作，一般較高濃度樣品均能得到滿意結(jié)果。但對(duì)于低濃度或處于臨界值樣品，孵育條件對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性可能有影響。為此，筆者設(shè)定了4組干、濕孵育條件，選擇不同濃度HBsAg樣品進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，觀察各樣品OD值，以遴選出*孵育條件。

    1  材料與方法

    1.1  材料  HBsAg血清樣品來(lái)自本院門診病人。ELISA法HBsAg檢測(cè)試劑盒，由上?？迫A生物實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20080810，效期半年。德國(guó)HUMAN2000型酶標(biāo)儀。

    1.2  方法

    1.2.1  樣品準(zhǔn)備  將金標(biāo)法測(cè)得HBsAg陽(yáng)性的多份病人血清樣混合均勻，以生理鹽水稀釋成6個(gè)不同濃度樣品后備用。

    1.2.2  孵育條件  設(shè)4組孵育條件。（1）抗原抗體結(jié)合反應(yīng)和顯色反應(yīng)均在37℃濕盒中（濕式）中孵育；（2）抗原抗體結(jié)合反應(yīng)在37℃濕盒中（濕式）中孵育；顯色反應(yīng)在37℃培養(yǎng)箱（干式）中孵育；（3）抗原抗體結(jié)合反應(yīng)在37℃培養(yǎng)箱（干式）中孵育，顯色反應(yīng)在37℃濕盒中（濕式）中孵育；（4）抗原抗體結(jié)合反應(yīng)和顯色反應(yīng)均在37℃培養(yǎng)箱（干式）中孵育?？乖贵w結(jié)合反應(yīng)時(shí)間均為30min，顯色反應(yīng)時(shí)間均為20min。

    1.2.3  實(shí)驗(yàn)操作  加樣、洗板、酶標(biāo)儀讀數(shù)、結(jié)果判定參考《臨床檢驗(yàn)管理與技術(shù)規(guī)范》［1］及試劑盒使用說(shuō)明書操作。

    2  結(jié)果

    6份血清樣品及陰性、陽(yáng)性對(duì)照顯色后按規(guī)定各加50μl終止液，振蕩均勻置酶標(biāo)儀上，以450/630nm雙波長(zhǎng)讀取OD值。陰性對(duì)照以0.05計(jì)， 臨界值=0.05×2.1，測(cè)定管OD/臨界值≥1為HBsAg陽(yáng)性，反之陰性。4種孵育條件各孔OD結(jié)果見表1。結(jié)果顯示5#血清在第3組、第4組條件下HBsAg陰性，第1組、第2組條件下HBsAg陽(yáng)性。表1  4種孵育條件下ELISA測(cè)定不同濃度HBsAg OD值

    3  討論

    抗原抗體和酶促反應(yīng)有許多影響因素，溫度是重要因素之一，在反應(yīng)達(dá)到zui適溫度前，反應(yīng)速率與溫度增加呈正比關(guān)系。目前，IFCC和我國(guó)臨床生化檢驗(yàn)中推薦溫度為37℃［2］，同時(shí)為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，要求誤差不能大于±0.5℃。在酶免反應(yīng)中，酶標(biāo)板各孔內(nèi)及孔間升溫達(dá)到37℃需要一定時(shí)間，如果傳熱媒介不同，升降溫速率則不同，結(jié)果將產(chǎn)生差異。從本文的試驗(yàn)結(jié)果看，濕式孵育優(yōu)于干式孵育，特別是對(duì)抗原抗體結(jié)合階段影響較大，直接影響到低濃度樣品的檢測(cè)結(jié)果，這可能與水媒介傳熱均勻與快速有關(guān)。因此，建議酶免反應(yīng)盡可能使用水浴箱，要求固相板放入水中，以減少受熱不均。

【參考文獻(xiàn)】
  1 陸永綏,張偉民.臨床檢驗(yàn)管理與技術(shù)規(guī)范.杭州:浙江大學(xué)出版社,2007，617.

2 周新,涂植光.臨床生物化學(xué)和生物化學(xué)檢驗(yàn).北京:人民衛(wèi)生出版社,2003，142.