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- 基因工程疫苗的制備
- 1. 制備基因工程苗用酶和載體酶是進(jìn)行基因工程*的試劑。用于基因工程的工具酶主要是限制性核酸內(nèi)切酶和DNA修飾酶（連接酶），限制性核酸內(nèi)切酶簡稱限制酶，是一類水解DNA的磷酸二酯酶，用于基因工程的限制酶，主要是能專一的識別4～6個核苷酸序列，并有專一的斷裂位置或切點(diǎn)的酶，如EcoRI、HindⅢ、PstI、BamHI等。DNA修飾酶是將目的基因的DNA片段與載體DNA分子在體外連接起來，構(gòu)成重組體DNA分子，這類酶主要有T4DNA連接酶（從T4噬菌體感染的大腸桿菌中分離出來的）等。
- 基因的載體，可以攜帶外源DNA片段，進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行增殖和表達(dá)，作為基因的載體，應(yīng)具有以下的特征：能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制，即使有外源DNA片段與其共價連接也不影響其復(fù)制；應(yīng)具有合適的限制酶識別位點(diǎn)，以便與外源DNA片段連接；應(yīng)具有某些遺傳標(biāo)記，以便于重組體的選擇。常用的載體有質(zhì)粒（如大腸桿菌質(zhì)粒pBR322、 pSC101、Co1EI）、噬菌體（λ噬菌體和M13噬菌體）、粘性質(zhì)粒（由質(zhì)粒DNA和λ噬菌體的COS區(qū)域構(gòu)建而成，它不但具有以上兩種載體的優(yōu)點(diǎn)，而且能與大片段的外源DNA連接構(gòu)成重組體DNA分子）及病毒（如牛痘苗病毒、禽痘病毒、腺病毒、乳多空病毒等）。
- 2.基本程序大致包括以下五個步驟：
- *步是分離目的基因，獲得目的DNA片段的方法主要有兩種，一是直接從細(xì)胞基因組中分離，二是人工合成。
- 第二步是將DNA片段和載體在體外連接重組，成為重組DNA分子，多采用連接酶的方法連接。
- 第三步是基因克隆，即將重組體DNA分子，引進(jìn)合適的宿主細(xì)胞（大腸桿菌、酵母）中增殖。根據(jù)所用載體的不同，可選用轉(zhuǎn)化（以質(zhì)粒作載體時，重組體DNA分子以此種方式進(jìn)入感受態(tài)的宿主細(xì)胞，以獲得轉(zhuǎn)化子菌落）、轉(zhuǎn)染（λ噬菌體作載體時，構(gòu)成的重組體DNA分子，以此種方式進(jìn)入宿主細(xì)胞，可轉(zhuǎn)染得到噬菌斑）、轉(zhuǎn)導(dǎo)（λ噬菌體DNA與外源DNA組成的重組體DNA分子，與噬菌體蛋白組裝成具有感染力的噬菌體顆粒，即人工包裝的噬菌體顆粒，引入宿主細(xì)胞）的方法，往宿主細(xì)胞引入重組體DNA分子。
- 第四步是目的基因克隆的篩選與鑒定，即從大量攜帶重組體DNA分子的細(xì)胞中分離出帶目的基因的細(xì)胞。因?yàn)椴皇撬械募?xì)胞都能獲得重組體DNA分子，為了獲得攝取了重組體DNA分子細(xì)胞，需經(jīng)篩選，才能將其與未攝取重組體DNA分子的細(xì)胞區(qū)別開來，并作進(jìn)一步鑒定。篩選含有重組體DNA分子細(xì)胞的方法，一般都是以載體DNA及目的基因的遺傳標(biāo)記及分子特征為依據(jù)，并結(jié)合受體細(xì)胞的基因表型而建立起來的。由于許多質(zhì)粒都具有抗生素等藥物的抗性標(biāo)記，因此，在含有一定濃度抗生素的選擇培養(yǎng)基上，可以很容易地把攝取了重組體DNA分子，因同時也獲得了抗生素抗性的細(xì)胞辨認(rèn)出來。但藥物篩選只是一個方面，依據(jù)它只能判斷質(zhì)粒載體是否進(jìn)入了受體細(xì)胞，還不能確定受體細(xì)胞是否攝取了含有目的基因的重組體DNA分子。
- 對于重組體DNA分子的鑒別，通常是在抽提出重組質(zhì)粒DNA后，用凝膠電泳法或電鏡觀察其分子大小，用限制酶酶解，觀察其酶切圖譜進(jìn)行。還可采用菌落原位雜交法來進(jìn)行鑒定，即將菌落從zui初生長的平板上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，用堿裂解濾膜上的菌落，使DNA分子游離，變性，并固定在濾膜上，隨即用同位素標(biāo)記的與目的基因互補(bǔ)的DNA或RNA探針雜交，zui后通過濾膜的放射自顯影鑒定菌落，并從zui初生長的平皿上挑選出放射自顯影呈陽性的菌落。
- 第五步是基因表達(dá)，這是指宿主細(xì)胞在大量繁殖過程中外源DNA在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯，表達(dá)生成的產(chǎn)物（蛋白質(zhì)），在細(xì)胞內(nèi)不被分解，而分泌到細(xì)胞外面。表達(dá)產(chǎn)物若為較小的多肽，或是對細(xì)菌蛋白酶極為敏感的蛋白質(zhì)，形成后，通常即被迅速降解。為了保證外源基因表達(dá)產(chǎn)物能分泌到細(xì)胞外而不被降解，通?？梢园淹庠椿虿迦朐谳d體的某些結(jié)構(gòu)基因中間，在這種情況下，表達(dá)產(chǎn)物是融合蛋白質(zhì)，融合蛋白質(zhì)可以抵抗內(nèi)源蛋白酶的降解，又可以在細(xì)胞信號肽的引導(dǎo)下分泌到細(xì)胞外。
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