儲(chǔ)存條件：
細(xì)胞裂解液R 4℃放置；溶菌酶（100ug/ul） -20℃保存；其他試劑室溫保存。另外，為了去除RNA 中少量殘存的DNA，客戶可根據(jù)需要購(gòu)買DNase I。
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本試劑盒可從細(xì)菌細(xì)胞中快速提取總RNA，可同時(shí)處理大量不同樣品。提取的總RNA 純度高，沒(méi)有蛋白和其它雜質(zhì)的污染，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern blot、Dot blot、polyA 篩選、體外翻譯、RNase 保護(hù)分析和分子克隆等多種下游實(shí)驗(yàn)。預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：
1. 經(jīng)常更換新手套。因?yàn)槠つw經(jīng)常帶有細(xì)菌，可能導(dǎo)致RNase 污染。
2. 使用無(wú)RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染。
3. RNA 在細(xì)菌細(xì)胞裂解液中時(shí)不會(huì)被RNase 降解。但提取后繼續(xù)處理過(guò)程中應(yīng)使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 小時(shí)，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鐘，然后用水*清洗，再滅菌，即可去除RNase。
4. 配制溶液應(yīng)使用RNase-free ddH2O。（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%（ v/v），混勻后放置過(guò)夜，高壓滅菌。）
使用前注意事項(xiàng)
1. 裂解液在儲(chǔ)存時(shí)可能會(huì)形成沉淀，如果有沉淀出現(xiàn)，請(qǐng)加熱溶解后使用。
2. *次使用前應(yīng)在漂洗液RW 中加入無(wú)水乙醇，加入量請(qǐng)參見(jiàn)瓶上標(biāo)簽。
操作步驟
柱平衡步驟：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl 平衡液，12,000 rpm（~13,400×g ）離心1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中備用（請(qǐng)使用當(dāng)天處理過(guò)的柱子）。
1． 4℃12,000 rpm（~13,400×g）離心2 分鐘收集菌體（收集菌體的zui大量不超過(guò)1×109），仔細(xì)去除所有培養(yǎng)基上清。
注：如果培養(yǎng)基上清去除不*，將對(duì)第二步中的細(xì)胞壁消化過(guò)程產(chǎn)生抑制。
2． 用含有溶菌酶的100 ul 細(xì)胞懸浮液（客戶自己配制，配制方法見(jiàn)下表）*重懸菌體，孵育時(shí)間如下。
細(xì)胞懸浮液中的溶菌酶終濃度 孵育時(shí)間（室溫）
G-細(xì)菌 400 ug/ ml 3-5 min
G+細(xì)菌 3 mg/ ml 5-10 min
3. 加入1ml 裂解液R，渦旋振蕩混勻，若出現(xiàn)不溶性沉淀，12000 rpm（~13,400×g）離心2 分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中。
4. 每1ml 裂解液R加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，劇烈振蕩15秒并將其在室溫下孵育3分鐘。
5. 于4℃ 12，000rpm 離心10分鐘，樣品會(huì)分成三層：下層有機(jī)相，中間層和上層無(wú)色的水相，RNA存在于水相中。水相層的容量大約為所加R體積的60%，把水相轉(zhuǎn)移到吸附柱中（吸附柱套在收集管內(nèi)）。
6. 12，000rpm 離心45秒，棄掉廢液，將吸附柱重新套回收集管。
7. 加入500μl漂洗液RW（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），12,000 rpm 離心45秒，棄掉廢液。
8. 加入500μl漂洗液RW，12,000 rpm 離心45秒，棄掉廢液。
9. 將吸附柱放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
10. 取出吸附柱，放入一個(gè)新的RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加60-100μl RNase free water， 室溫放置2分鐘， 12,000 rpm 離心1分鐘。得到RNA溶液。
（洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要RNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積， 但是zui小體積不少于50μl，體積過(guò)小降低RNA洗脫效率，減少RNA產(chǎn)量。）
RNA純度及濃度檢測(cè)
完整性： RNA 可用普通瓊脂糖凝膠電泳 （電泳條件：膠濃度1.2%；0.5×TBE 電泳緩沖液；150v，15 分鐘）檢測(cè)完整性。由于細(xì)胞中70%-80%的RNA 為rRNA，電泳后UV 下應(yīng)能看到非常明顯的rRNA 條帶。28S rRNA 的量約為18S rRNA 的兩倍，說(shuō)明RNA 的完整性較好。
純度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的指標(biāo)。高質(zhì)量的RNA，OD260/OD280 讀數(shù)在1.8-2.1 之間，比值為2.0 是高質(zhì)量RNA 的標(biāo)志。OD260/OD280 讀數(shù)受測(cè)定所用溶液的pH 值影響。同一個(gè)RNA 樣品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中測(cè)出的OD260/OD280 讀數(shù)1.8-2.1 之間，在水溶液中所測(cè)讀數(shù)則可能在1.5-1.9 之間，但這并不表示RNA 不純。
濃度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free ddH2O稀釋n 倍，用RNase-freeddH2O 將分光光度計(jì)調(diào)零，取稀釋液進(jìn)行OD260, OD280 測(cè)定，按照以下公式進(jìn)行RNA濃度的計(jì)算：
終濃度（ng/μl）= （OD260）×（稀釋倍數(shù)n）×40
DNase I儲(chǔ)存液的配制
將DNase I 干粉（1500 U）溶解在550 μl RNase-free ddH2O 中，輕柔混勻，分裝后-20℃貯存（可保存9 個(gè)月）。
DNA reaction buffer：
100mM Tris-HCl（ pH 7.5 ）
25mM MgCl2
5 mM CaCl2
注意：從-20℃融化后的DNase I 儲(chǔ)存液保存于4℃（可保存6 周），不要再次凍存。