HL-60細(xì)胞之細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)指南

HL-60細(xì)胞介紹

HL-60細(xì)胞株http://www.atcccell.com/ATCCcell-Products-14206745/即人前髓細(xì)胞為白血病株（早幼粒細(xì)胞）。該細(xì)胞經(jīng)過不同的處理可誘導(dǎo)分化為嗜中性或嗜酸性細(xì)胞，具有血細(xì)胞的一些特征。

HL-60細(xì)胞之細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)指南如下：

在培養(yǎng)基中補(bǔ)充牛胎兒血清.HEPES，抗生素類化學(xué)物質(zhì)，L-谷氨酰胺，通過懸浮培養(yǎng)，hl-60細(xì)胞能持續(xù)增值。加倍時(shí)間大約是36-48小時(shí)。這個(gè)細(xì)胞株是在National Cancer Institute[1]（美國國家癌癥研究所）從一個(gè)36歲患急性早幼粒細(xì)胞白血病的男人身上得到的。

HL60細(xì)胞增值需要transferrin（轉(zhuǎn)鐵蛋白）和胰島素受體，細(xì)胞表面表達(dá)有這兩種物質(zhì)。這兩種物質(zhì)是必須的，一旦這兩種復(fù)合物任意一種從無血清培養(yǎng)基中除去，那么hl-60細(xì)胞立即停止增值。成熟的粒細(xì)胞自發(fā)分化可以用 dimethyl sulfoxide （DMSO）（二甲亞砜）retinoic acid（維甲酸）等化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)。其他諸如 1,25-dihydroxyvitamin D3（二羥維生素D）. 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate （TPA）（對(duì)二苯甲酸），GM-CSF等化學(xué)物質(zhì)能夠分別誘導(dǎo)hl-60細(xì)胞分化出單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞的表型。

懸浮白血病細(xì)胞HL-60的培養(yǎng)上清液對(duì)HUVECs的血管形成能力的影響
1 材料與方法
1.1 材料及試劑
1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)材料： RPMI1640培養(yǎng)基，小牛血清，人急性白血病細(xì)胞株（Hl-60），人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）。
1.1.2 主要藥品與試劑：二甲亞砜（DMSO）；MTT，Amresco公司產(chǎn)品；0.25%胰酶；HEPE；逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒；瓊脂糖凝膠，美國Sigma公司產(chǎn)品。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 細(xì)胞培養(yǎng)： HL-60懸浮細(xì)胞、HUVECs在含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液中于5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。K562細(xì)胞每1-2天換液傳代一次，HUVECs每2-3天換液傳代一次。
2.2 MTT比色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，每板種2組，每組十個(gè)復(fù)孔，共種3板。待4小時(shí)鏡下觀察細(xì)胞貼壁后，*組每孔加培養(yǎng)12h的HL-60細(xì)胞上清100μL，第二組每孔加1640培養(yǎng)基100μL，分別培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入MTT（5mg/ml）20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清液，每孔加DMSO180μL，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上以570nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，讀取吸光度（A）值。
2.3 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HUVECs CyclinE及VEGF mRNA表達(dá)：a.對(duì)照組: 將HUVECs濃度調(diào)整為1×105/ml的細(xì)胞懸液,接種5ml于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，4小時(shí)鏡下觀察其貼壁后加入5ml培養(yǎng)基。 b.實(shí)驗(yàn)組: 將HUVECs濃度調(diào)整為1×105/ml細(xì)胞懸液,接種5ml于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，4小時(shí)鏡下觀察其貼壁后加入培養(yǎng)12h的K562細(xì)胞上清液5ml。兩組細(xì)胞培養(yǎng)72h后，棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，PBS輕柔清洗細(xì)胞2-3次，Trizol法提取兩組HUVECs總mRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物為模板按，按照PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3]擴(kuò)增CyclinEmRNA及VEGFmRNA的引物序列，并用Oligo引物設(shè)計(jì)軟件檢測(cè)。CyclinEmRNA上游引物：5-CTGGATGTTGACTGCCTTGA-3，下游引物：5-CCGCTGCTCTGCTTCTTAC-3。VEGFmRNA上游引物：5-CAAATCCACCCACTATGA-3，下游引物：5-CCGCCTCGGCTTGTC-3.β-action上游引物：5-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3 ，下游引物：5-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3。反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min,95℃變性40s,53℃退火35s,72℃延伸35s，共30個(gè)循環(huán)，zui后于72℃保溫10min終止反應(yīng)。然后取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（means±S.E.）。多組均數(shù)間的比較采用F檢驗(yàn)。以P＜0.05或P＜0.01判斷差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3 結(jié)果
3.1 K562細(xì)胞上清對(duì)HUVECs促增殖作用
噻唑藍(lán)（MTT）還原法檢測(cè)兩組培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后HUVECs增殖速度（圖1）。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組中HUVECs較對(duì)照組HUVECs增殖明顯加快，并呈時(shí)間依賴性， 72小時(shí)后差異具有顯著性意義（P<0.05）。



圖1 兩組培養(yǎng)24h、48h、72hHUVECs吸光值比較（n=10 *P<0.05） 3.2 實(shí)驗(yàn)組HUVECs較對(duì)照組HUVECs CyclinEmRNA表達(dá)明顯增高
實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組培養(yǎng)72h后，RT-PCR檢測(cè)顯示：實(shí)驗(yàn)組HUVECs較對(duì)照組HUVECs CyclinEmRNA表達(dá)明顯增加。灰度掃描顯示實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組HUVECs CyclinEmRNA表達(dá)差異有顯著性意義（P<0.01）（圖2）。



圖2 RT-PCR檢測(cè)組兩HUVECs CyclinEmRNA表達(dá)水平 （**p<0.01）
3.3 實(shí)驗(yàn)組HUVECs較對(duì)照組HUVECs VEGFmRNA表達(dá)明顯增高
實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組培養(yǎng)72h后，RT-PCR檢測(cè)顯示：實(shí)驗(yàn)組HUVECs較對(duì)照組HUVECs VEGFmRNA表達(dá)明顯增加?；叶葤呙栾@示實(shí)驗(yàn)組HUVECs較對(duì)照組HUVECs VEGFmRNA表達(dá)差異有顯著性意義（P<0.01）（圖3）。




（（來源：乾思生物細(xì)胞培養(yǎng)網(wǎng)  http://www.atcccell.com/   ）