一、簡(jiǎn)介：

SSR簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（Simple sequence repeat, 簡(jiǎn)稱SSR標(biāo)記），也叫微衛(wèi)星序列重復(fù)，是由一類由幾個(gè)核苷酸（1-5個(gè)）為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的重復(fù)序列，長(zhǎng)度較短，廣泛分布在染色體上。由于重復(fù)單位的次數(shù)的不同或重復(fù)程度的不*相同，造成了SSR長(zhǎng)度的高度變異性，由此而產(chǎn)生SSR標(biāo)記或SSLP標(biāo)記。雖然SSR在基因組上的位置不盡相同，但是其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以用微衛(wèi)星區(qū)域特定順序設(shè)計(jì)成對(duì)引物，通過(guò)PCR技術(shù)，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可顯示SSR位點(diǎn)在不同個(gè)體間的多態(tài)性。

優(yōu)點(diǎn)：

（1）標(biāo)記數(shù)量豐富，具有較多的等位變異，廣泛分布于各條染色體上；

（2）是共顯性標(biāo)記，呈孟德?tīng)栠z傳；

（3）技術(shù)重復(fù)性好，易于操作，結(jié)果可靠。

缺點(diǎn)：

開(kāi)發(fā)此類標(biāo)記需要預(yù)先得知標(biāo)記兩端的序列信息，而且引物合成費(fèi)用較高。

二、操作程序：

取葉片→磨樣→提取DNA→PCR擴(kuò)增→電泳檢測(cè)→染色→讀帶標(biāo)記。

1、DNA提取

按照Doyle和Dickson（1987）CTAB法（`Cetyl triethyl ammonium bromide）并略加改進(jìn)的程序進(jìn)行，具體步驟如下：

①  成熟期取葉片加液氮研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，-20℃冰箱保存；

②  加入600μl 65℃的2×CTAB混勻并置于65℃水浴中保溫30-60分鐘；

③  取出，冷卻，上下?lián)u勻后，加入600微升24:1的氯仿異戊醇；

④  12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液于另一個(gè)1.5ml的離心管中；

⑤  加異丙醇，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，倒掉上清液；

⑥  干后用100%的灑精清洗，干后加適量TE。

2、PCR擴(kuò)增

模板DNA的濃度大約25ng/μl,擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μl。具體如下：

Sterile ddH2O        11μl

PCR Buffer              3μl

dNTP-mix                 0.5μl

Primer1                     1μl

Primer2                     1μl

Taq polymerase      0.5ul（2U/μl）

DNA                            3μl  

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋海?h30min）  

①  預(yù)變性：94℃，5分鐘；

②  變  性：94℃，40秒；

③  退  火：55℃  40秒；

④  延  伸：72℃，1分鐘；

⑤  循  環(huán)：從2到4共38個(gè)循環(huán)；

⑥  72℃下zui后延伸5分鐘；4℃ 5min，擴(kuò)增產(chǎn)物置于4℃的冰箱保存。

3、擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分離

制膠→灌膠→上樣→電泳。

擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺變性膠電泳分離，步驟如下：

①  準(zhǔn)備電極液（1×TBE）；

②  將梳子撥出，并迅速用電極液沖洗膠面；

③  不預(yù)電泳；

④  點(diǎn)樣，電泳220V；

⑤  拆板，并及時(shí)將內(nèi)板、邊條及梳子洗凈。

4、凝膠染色

①  固定：10%醋酸，5分鐘；

②  染色：10分鐘；

③  漂洗：dH2O，5-10秒；

④  顯色：甲醛-NaOH，直到滿意為止；

⑤  漂洗：dH₂O，2分鐘。

 5、自封帶封膠，讀帶標(biāo)記，數(shù)碼照相攝像，室溫風(fēng)干