猴狂犬病毒（RV）ELISA試劑盒使用說(shuō)明書

目的：該試劑盒使用于檢測(cè)猴血清，血漿及相關(guān)液體樣本中狂犬病毒（RV）。

猴狂犬病毒（RV）ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)原理：該試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定標(biāo)本中猴狂犬病毒（RV）。用純化的猴狂犬病毒（RV）抗體包被微孔板，制成固相抗體，可以與樣品中狂犬病毒（RV）相結(jié)合，經(jīng)過(guò)洗滌去除未結(jié)合的抗體和其他成分后再和HRP標(biāo)記的狂犬病毒（RV）抗體想結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加入底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化為終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），與CUTOFF值進(jìn)行對(duì)比，從而判定標(biāo)本中猴狂犬病毒（RV）是否存在。

猴狂犬病毒（RV）ELISA試劑盒樣本處理和要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心月20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如果出現(xiàn)沉淀，需要再次離心。

2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心月20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如果有沉淀形成，需要再次離心。

3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心約20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如果有沉淀形成，需要再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心約20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心約20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如果有沉淀形成，需要再次離心。

5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍需保持在2-8℃。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心約20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

6. 標(biāo)本采集后應(yīng)盡早進(jìn)行提取，提取時(shí)要按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若果不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，必須避免反復(fù)凍融。

7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

猴狂犬病毒（RV）ELISA試劑盒操作步驟：

1.編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽(yáng)性對(duì)照2孔、空白對(duì)照1孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）。

2.加樣：分別在陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照50μl。然后在待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸碰到孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3.溫育：用封板膜封板后防止在置于溫度為37℃的溫度下溫育30分鐘。 

4.配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用。

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。 

7.溫育：同3。

8.洗滌：同5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色）。

11.測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

猴狂犬病毒（RV）ELISA試劑盒結(jié)果判定：

試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00; 陰性對(duì)照平均值≤0.10臨界值（CUT OFF）。

計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15陰性。

判定：1、樣品OD值< 臨界值（CUT OFF）者為狂犬病毒（RV）陰性陽(yáng)性。

      2、樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為狂犬病毒（RV）陽(yáng)性。