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DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：脈沖場(chǎng)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)
脈沖場(chǎng)凝膠電泳是在兩個(gè)不同方向的電場(chǎng)周期性交替進(jìn)行的，可分離長(zhǎng)至5Mb的DNA分子，其工作原理是DNA分子在交替變換方向的電場(chǎng)中作出反應(yīng)所需的時(shí)間取決于它的大小。較小的分子重新定向較快，因而在凝膠中移動(dòng)也較快，于是不同大小的分子被成功分離。
實(shí)驗(yàn)方法
- 倒轉(zhuǎn)電場(chǎng)
| 實(shí)驗(yàn)材料 | DNA |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | GTBE TBE 瓊脂糖 |
| 儀器、耗材 | 電泳儀 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 1. 制備用于水平電泳的1%瓊脂糖凝膠，放入電泳裝置，其上覆蓋以2~3 mm 的GTBE或TBE緩沖液。 2. 加入液體樣品。裝好蠕動(dòng)泵用于電泳緩沖液循環(huán)。 3. 對(duì)于微型凝膠調(diào)整循環(huán)速度至5~10ml/min 對(duì)于大型凝膠則用20~50 ml/min。 4. 將管端與凝膠槽中的再循環(huán)口相連，或直接放入緩沖液槽。 5. 將可編程的轉(zhuǎn)換裝置與恒壓直流電源相連，然后將凝膠裝置與轉(zhuǎn)換裝置相連（見(jiàn)下表），開(kāi)始電泳直到溴酚藍(lán)遷移1 cm，開(kāi)啟轉(zhuǎn)換裝置及蠕動(dòng)泵。 6. 與標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠一樣進(jìn)行溴化乙錠染色及照相。經(jīng)酸處理使DNA脫嘌呤后，凝膠可進(jìn)行Southern雜交。  （1）這些公式假定使用0.5×TBE緩沖液；對(duì)于GTBE和TAE緩沖液，分離的片段將稍大，并且電泳速度分別要快約20%和30%。 （2）變量：T，溫度（℃）；V，電場(chǎng)通度（V/cm）；A，瓊脂糖百分濃度（對(duì)于脈沖場(chǎng)級(jí)瓊脂糖乘以0.8）；脈沖時(shí)間（對(duì)于倒轉(zhuǎn)電場(chǎng)凝膠指反向時(shí)間，單位s）；R，正向與反向電泳時(shí)問(wèn)比率；θ，改向角度。 （3）倒轉(zhuǎn)電場(chǎng)凝膠不能分離此范圍以外的長(zhǎng)度，變角度凝膠可以分離此范圍以外的片段，且效果不是很好。 |
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