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DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：Southern 印跡實(shí)驗(yàn)
Southern印跡法是將DNA段從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移至膜支持物上，使DNA段固定，因此該膜半*性地重現(xiàn)出凝膠電泳的帶型。
實(shí)驗(yàn)方法
- 印跡法
- 堿性緩沖液法
- 向下毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法
- 電轉(zhuǎn)印法
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 本方案是專門為將瓊脂糖凝膠印跡至不帶電荷或帶正電荷的尼龍膜上而設(shè)計(jì)的，稍作修改后同樣可用于硝酸纖維素膜方法。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | DNA |
| 試劑、試劑盒 | HCl NaCl Tris NaOH SSC 溴化乙錠 |
| 儀器、耗材 | 電泳儀 紫外透射儀 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一、向上毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法的轉(zhuǎn)移疊層系統(tǒng)：
圖一、向上毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法的轉(zhuǎn)移疊層系統(tǒng)，A表示海綿法，B表示濾紙橋法 1. 用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化DNA，與合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)一起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。 2. 用溴化乙錠染色，在凝膠的側(cè)沿放一把直尺進(jìn)行照相，便于以后識(shí)別電泳帶在膜上的位置。 3. 按如下方法處理凝膠，室溫下輕輕搖動(dòng)，要確保凝膠被*覆蓋。 （1）蒸餾水：約10倍于凝膠體積的0.25 mol/l HCl，30 min。 （2）蒸餾水：約10倍體積的變性液，20 min，2次。 （3）蒸餾水：約10倍體積的中和液，20 min，2次。 4. 如圖一所示安裝轉(zhuǎn)移疊層系統(tǒng)，其各層組成依次為 （1）海綿或固體支持物，置于一個(gè)盛有足以浸沒海綿一半高度的20XSSC的平皿中。 （2）1張Whatman 3 MM 濾紙橋，3張Whatman 3 MM 濾紙，凝膠，包裹于凝膠邊緣的塑料薄膜。 （3）1張?jiān)谡麴s水中平衡過的尼龍膜（或用蒸餾水浸濕，然后在20XSSC中平衡10 min 的硝酸纖維素膜），5張 Whatman濾紙及一疊4 cm 紙巾塔。 （4）每加一層均將其用20XSSC浸濕，并用一根10 ml 玻璃吸管在其表面小心地滾動(dòng)以除去所有氣泡。 5. 將一塊玻璃平板放于疊層上面，其上加一重0.2~0.4 kg 的重物以使各層固定，放置。 6. 取出雜交膜，用鉛筆在膜上標(biāo)記樣品孔的位置，井切去一角以標(biāo)示方向。 7. 用2×SSC漂洗雜交膜，然后將其放在一張Whatman 3 MM 濾紙上，使其*干燥。 8. 將尼龍膜置于可透過紫外線的塑料夾層中，帶有DNA的一面朝下，置于紫外透射儀（波長254 nm）上進(jìn)行照射。 |
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