一、電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備

1.用槍頭挑取單克隆菌落，投入盛有10ml LB液體培養(yǎng)基的50ml離心管中。（同時做培養(yǎng)基和槍頭的空白對照）

2.37℃，220rpm，培養(yǎng)14-16個小時。

3.第二天，以1：100的比例將這10ml菌液倒入1000ml LB液體培養(yǎng)基中，37度，220rpm，振搖2-3小時，每半小時測一次OD，當(dāng)OD值達到0.3-0.4時，停止培養(yǎng)。

4.將菌液在冰上預(yù)冷30分鐘，隨后將菌液分裝到500ml 預(yù)冷的離心杯中，4℃，2500rpm離心10分鐘。

5.棄上清，離心杯中加入少量ddH₂O，使沉淀懸浮后，再將水注滿離心杯，4℃，4000rpm離心10分鐘。

6.棄上清，加少量滅菌水，重懸菌體，再將水注滿離心杯，4000rpm，4℃，離心10min。

7.棄上清，往離心杯中加入少量10%甘油（滅菌，預(yù)冷），重懸菌體，再加滿10%甘油,  4℃, 4000rpm, 離心10min。

8.棄上清，每個離心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀懸浮后，將菌液以300ul/管分裝于1.5ml的離心管中，-80 ℃冰箱中保存。同時取100 μl感受態(tài)加0.01ng puc18直接電穿孔轉(zhuǎn)化，檢測轉(zhuǎn)化效率。

9.  次日觀察轉(zhuǎn)化子生長情況，并記錄。

二、連接產(chǎn)物純化

1．將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列試劑:

10μl  of  ddH₂O

2μl   of  3M NaAC（PH5.2）

50μl  of  無水乙醇

輕輕混勻，稍微離心并將其置于-20℃放置1小時以上；

2.4℃，top Speed 離心30分鐘；

3.小心移去上清，避免接觸到管底的沉淀物；

4.加入500μl70%的乙醇，輕輕顛倒幾次洗滌沉淀（注：不要離心混勻）；

5.4℃，top Speed離心5分鐘；

6.小心移去上清，將此Eppendorf管置空氣中直至無乙醇?xì)馕叮?/p>

7.加入10μlddH₂O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃長期保存?zhèn)溆茫?/p>

三、電轉(zhuǎn)化

1.從-80℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍；

2.取1 μl 純化后的質(zhì)粒于一1.5ml的離心管中，將其和0.1CM的電極杯一起置于冰上預(yù)冷。

3.將40～100ul解凍的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至此1.5ml 的離心管中，小心混勻，冰上放置10min。

4.打開電轉(zhuǎn)儀，調(diào)至Manual，調(diào)節(jié)電壓為2.1KV。

5.將此混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進入電極杯的底部；

6.將電極杯推入電轉(zhuǎn)化儀，按一下pulse鍵，聽到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入1000μl的SOC液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。

7．37℃，220－250rpm復(fù)蘇1小時。

8. 取20μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加160μlSOC涂板，放于37℃溫室，過培養(yǎng)，次日查看轉(zhuǎn)化結(jié)果。其余菌液加1：1的30%的甘油后混勻－80℃保存。

注：每塊加有Amp的平板上均勻涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。

四、電擊杯清洗流程

1.用清水將電擊杯稍沖一下。

2.向電擊杯中加入的75%酒精浸泡2hr。

3.棄去酒精，再用蒸餾水沖洗2~3遍，然后用1ml的槍吸取超純水反復(fù)吹打電擊杯10遍以上。

4.加入無水乙醇2ml于電擊杯中，浸泡30分鐘。

5.棄去無水乙醇，于通風(fēng)廚內(nèi)揮干乙醇。

6.將清洗好的電擊杯放入-20 ℃冰箱內(nèi)待用。

注：1．不同樣品使用的電機杯應(yīng)分開；

2．每周用1%酒精浸泡30分鐘。