實(shí)驗(yàn)原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）技術(shù)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它是一種簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)的用來顯示在PCR反應(yīng)產(chǎn)物中單堿基突變（點(diǎn)突變）的手段。該方法已被用做癌基因和抑癌基因突變的篩查檢測(cè)，遺傳病的致病基因分析和基因診斷，基因制圖等領(lǐng)域。

在SSCP測(cè)定中，雙鏈DNA（dsDNA）被變性成為單鏈DNA（ssDNA），每一條單鏈DNA都基于它們的內(nèi)部序列而呈現(xiàn)出一種*的折疊構(gòu)象，即使同樣長(zhǎng)度的DNA單鏈因其堿基順序不同、甚至單個(gè)堿基的不同會(huì)形成不同的構(gòu)象。這些單鏈DNA在非變性條件下，用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，單鏈DNA的遷移率和帶型，都取決于其折疊構(gòu)象和電泳時(shí)的溫度。

試劑與材料

1．樣本DNA（100 ng/ml）、MTHFR上下游引物（5 pmol/ml）、Taq DNA聚合酶（5 U/ml）、10×PCR反應(yīng)緩沖液、4×dNTPs（2.5 mmol/L）、30%丙烯酰胺（交聯(lián)度49:1）、5×TBE緩沖液、10%過硫酸銨（現(xiàn)用現(xiàn)配）、TEMED、甲酰胺上樣緩沖液、固定液、銀染液、顯色液。

2．微量加樣器、PCR自動(dòng)熱循環(huán)儀、聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置。

實(shí)驗(yàn)步驟

一、PCR反應(yīng)

20 ml反應(yīng)體系成分如下：

模板DNA（100 ng/ml）        1 ml

10×PCR反應(yīng)緩沖液           2 ml

Taq DNA聚合酶（5 U/ml）   0.2 ml

4×dNTPs（2.5 mmol/L）      1 ml

MTHFR上下游引物          各 1 ml

ddH2O 加至終體積           20 ml

PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：

95℃ 5 min；

94℃ 30 s、62℃ 50 s、72℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)；

72℃ 7 min。

反應(yīng)結(jié)束后，置4℃保存。

二、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

1．制備6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠：30%聚丙烯酰胺（交聯(lián)度49:1）10 ml，5×TBE緩沖液10 ml，加蒸餾水至50 ml，加TEMED 25 ml、10%過硫酸銨250 ml，混勻后灌膠，插入加樣梳子。待膠*聚合后，拔出加樣梳子，安裝電泳裝置，加入電泳緩沖液（1×TBE），緩沖液應(yīng)高于加樣孔上緣，用注射器吸取緩沖液沖凈加樣孔。

2．取5 ml 擴(kuò)增產(chǎn)物加10 ml變性上樣緩沖液混勻，98℃變性10 min，迅速冰浴。

3．取5 ml混合液加到點(diǎn)樣孔中，以1～8 V/cm電泳4～5 h。

三、聚丙烯酰胺凝膠染色

1．拆下電泳裝置，取出聚丙烯酰胺凝膠，放到一個(gè)塑料盤內(nèi)，用蒸餾水沖洗1～2遍。

2．倒入固定液，固定8～10 min。

3．用蒸餾水沖洗1～2遍；倒入銀染液，銀染10～12 min。

4．用蒸餾水沖洗若干遍；倒入顯色液，顯色至出現(xiàn)清晰的銀染帶。

5．用蒸餾水浸泡聚丙烯酰胺凝膠，觀察PCR-SSCP結(jié)果。

結(jié)果判斷

觀察并記錄聚丙烯酰胺凝膠上的DNA單鏈帶，根據(jù)異常泳動(dòng)變位篩查突變樣本。

應(yīng)用

在遺傳學(xué)方面的有廣泛的應(yīng)用，例如，癌基因或抑癌基因的基因突變的篩查，遺傳病的致病基因的突變篩查和基因診斷等。

注意事項(xiàng)

1．靶DNA序列長(zhǎng)度不宜過長(zhǎng)，否則靈敏度下降。

2．DNA樣品在電場(chǎng)中泳動(dòng)的長(zhǎng)度一般要求在16～18 cm以上。

3．染色在塑料盤中進(jìn)行。