基因樣品

dNTP PCR混合液

PCR儀

1.  PCR混合液的制備

（1）Taq buffer（10×） 180 ul

（2）dNTP（2.5 mM） 20~25 ul

（3）Primer Forward（引物濃度在10 Pmol） 5 ul

（4）Primer Reverse（引物濃度在10 Pmol） 5 ul

（5）ddH₂O 147 ul

（6）Taq（2 U/ul） 12~15 ul

2.  常溫下隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化板上的轉(zhuǎn)化子，用滅菌的牙簽或槍頭挑取單個(gè)菌落（強(qiáng)調(diào)單個(gè)，不能是雙克?。贚B瓊脂糖平板上輕點(diǎn)，做一拷貝。

3.  然后將沾有菌體的牙簽或槍頭置于相應(yīng)的裝有PCR管中或者96空pcr反應(yīng)板（管子做好記號(hào)，如平板上點(diǎn)的是1#，則管子上也標(biāo)1#，以便篩選到克隆后的擴(kuò)到培養(yǎng)）。

4.  挑好單克隆菌落后將之前配制好的PCR混合液加入體系是30 ul。

5.  將混有菌體的PCR混合物置于PCR儀中，按常規(guī)條件擴(kuò)增。

6.  將擴(kuò)增出來(lái)的反應(yīng)液中加入溴酚藍(lán)或是其他染料，電泳檢測(cè)是否得到目的片斷。如有則為陽(yáng)性克隆。

7.  將已經(jīng)接種有菌落的平板置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使菌落擴(kuò)增。

8.  次日挑選陽(yáng)性克隆做進(jìn)一步篩選或培養(yǎng)。步驟2也可以不點(diǎn)板，直接接種搖菌，如果早上做PCR的話，下午就可以提質(zhì)粒，得到重組載體。

1.  設(shè)計(jì)引物很關(guān)鍵。一般如果是定向克隆，用載體上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克?。ㄈ鐔蚊盖谢蚱侥┒诉B接），一條引物用載體，一條引物用目的基因上的，這樣就可以比較方便的鑒定了，而且錯(cuò)誤概率很低。PCR條件的選擇接近*，同時(shí)挑取的菌體不宜太多，否則會(huì)有非特異性擴(kuò)增。

2.  使用的引物濃度不能太高，濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，反應(yīng)的循環(huán)數(shù)也不能太多，一般不超過(guò)25個(gè)。同時(shí)因?yàn)閿U(kuò)增的片段的GC含量問(wèn)題，有的GC含量很低，有的又很高，導(dǎo)致菌落PCR不容易擴(kuò)增出目的條帶，在此建議在設(shè)置PCR程序時(shí)以高GC的溫度為上限，每一循環(huán)降0.2度左右。