與直接原位PCR所不同的是，靶基因在擴(kuò)增時不進(jìn)行標(biāo)記基團(tuán)的摻入，而是標(biāo)記一段與擴(kuò)增片段互補(bǔ)的探針，在擴(kuò)增結(jié)束后，應(yīng)用此探針進(jìn)行原位雜交。因此，此處主要介紹原位雜交，其余方法同原位PCR。

一、預(yù)雜交

1. 試劑與配制

2×SSC

50%去離子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v）

預(yù)雜交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脫脂奶粉

2. 操作方法

①  在進(jìn)行完原位PCR擴(kuò)增后，用2×SSC預(yù)浸經(jīng)乙醇脫水、空氣干燥的玻片，并簡洗15min；

② 用50%去離子甲酰胺37℃孵育15min；

③加預(yù)雜交液20μl/片，在雜交溫度下孵育30min～2hr。

二、雜交

1. 試劑與配制

雜交液：50%去離子甲酰胺，5×SSC，10%硫酸葡聚糖，5×Denhardt’s 液，2%SDS，10mg/ml變性的鮭魚精DNA

2. 操作方法

①   棄預(yù)雜交液，加雜交液（含0.2～5μg/ml探針）10～20μl/片，覆蓋經(jīng)硅化的蓋玻片，石蠟?zāi)し馄蛳鹌つ喾馄?/p>

②  玻片置于濕盒中，42℃雜交12～18hr（過，但不能超過24hr）。

2. 注意事項

①  如果檢測mRNA，雙鏈探針應(yīng)變性處理，方法是95～100℃加熱10min后迅速置于冰中驟冷；

② 以單鏈探針檢測DNA時，DNA也需變性處理，將玻片置于70～80℃變性液（70%去離子甲酰胺，即甲酰胺/2×SSC，v/v）中10min；

③ 用雙鏈探針檢測DNA時，可按上述方法變性處理。

三、雜交后處理

1. 試劑與配制

2×SSC

Rnase（20μg/ml）

50%去離子甲酰胺

10mmol/L DTT

2. 操作方法

①  雜交完畢，用2×SSC浸泡玻片數(shù)分鐘，輕輕移去蓋玻片，再用2×SSC洗玻片1～2min；

② 2×SSC（含20μg/ml RNase，適宜RNA探針，DNA探針可省略此步）中洗片30min，37℃；

③  2×SSC/50%去離子甲酰胺，42℃×10min；

④1×SSC/50%去離子甲酰胺，37℃×30min，2次；

⑤ 4×SSC/10mmol/L DTT洗1hr；

⑥ 0.1×SSC洗2次，每次37℃×30min；

⑦ PBS中洗10min，即可進(jìn)行顯色，方法同上。