[實驗原理]

根據(jù)決定某等位基因的堿基性質(zhì)，設(shè)計3′端*個堿基分別與各等位基因的特異性堿基相匹配的序列特異性引物，在PCR反應(yīng)過程中，只有引物3′端*個堿基與決定特定等位基因的堿基互補時才能實現(xiàn)DNA 片段的*復制，根據(jù)PCR 產(chǎn)物的有無進行等位基因的分型。

[實驗器材]

PCR 擴增儀、電泳儀、電泳槽。

[實驗試劑]

引物1：5′-GCATCAAGTACCACTGGT-3′；引物2：5′-GCATTAAGTACCACTGAG-3′；共通引物：5′-GAGAAGTTGAGAAAGGGGT-3′。模板DNA、Taq 聚合酶、丙烯酰胺、電極緩沖液、上樣緩沖液等

[實驗方法]

1.PCR擴增PCR反應(yīng)體系為20μl（2個體系，分別為引物1和引物2），含模板2μl（約50ng），引物各1.5μl,dNTP1.6μl（0.4mM），10×Buffer緩沖液2μl，Taq酶1.0U，加雙蒸水至20.0μl；PCR反應(yīng)條件為94℃4min,94℃1.5min/52℃2.0min/72℃2.0min，30個循環(huán)。

2.PCR 擴增產(chǎn)物的檢測 取PCR擴增產(chǎn)物2μl，6%聚丙烯酰胺凝膠電泳（T=6%，C=3.3%，凝膠規(guī)格為82mm×64mm×0.75mm）。電極緩沖液為1×TBE。將加有1/5體積上樣緩沖液的酶切產(chǎn)物電泳，220 v 電壓，電泳2－3h。銀染顯色

[結(jié)果判定]

根據(jù)電泳譜帶的有無判定等位基因型別，僅有1 個體系檢測到譜帶者為相應(yīng)特異性引物對應(yīng)型（M 或N），2 個體系均檢測到譜帶者為MN 型。

[實驗討論]

1.注意事項 ①如引物結(jié)合序列存在堿基變異可能無擴增產(chǎn)物，導致錯誤判型；②在對照樣品分型準確的基礎(chǔ)上才能判定結(jié)果。