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蛋白質(zhì)技術(shù)專題：核蛋白的免疫熒光定位實(shí)驗(yàn)
免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展zui早的一種免疫熒光技術(shù)。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。
實(shí)驗(yàn)方法
- 免疫熒光定位法
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是采用熒光素標(biāo)記的已知抗體（或抗原）作為探針，檢測(cè)待測(cè)組織、細(xì)胞標(biāo)本中的靶抗原（或抗體），形成的抗原抗體復(fù)合物帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，由于受高壓汞燈光源的紫外光照射，熒光素發(fā)出明亮的熒光，這樣就可以分辨出抗原（或抗體）的所在位置及其性質(zhì)，并可利用熒光定量技術(shù)計(jì)算抗原的含量，以達(dá)到對(duì)抗原物質(zhì)定位、定性和定量測(cè)定的目的。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 核蛋白 |
| 試劑、試劑盒 | 甲醇 PB 一抗 二抗 |
| 儀器、耗材 | 顯微鏡 玻片 蓋玻片 滴管 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 1. 在22×22 mm 的1.5號(hào)蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞。理想條件下細(xì)胞應(yīng)長(zhǎng)到50%~70%匯合。 2. 在-20℃用100%甲醇固定細(xì)胞3分鐘。 3. 用PBS + 1% NGS洗三次，每次10分鐘。 4. 在濕盒里以適當(dāng)濃度的一抗室溫溫育1小時(shí)。 5. 用PBS + 1% NGS洗三次，每次10分鐘。 6. 在濕盒里與稀釋為4 ug/ml 的熒光標(biāo)記二抗室溫溫育1小時(shí)。 7. 用PBS洗四次，每次10分鐘。 8. 用封片劑將蓋玻片封在載波片上，用干凈的指甲油將蓋玻片封邊，防止蓋玻片滑動(dòng)。 |
| 注意事項(xiàng) | 1. 要在蓋玻片一邊角落做記號(hào)，以知道細(xì)胞在蓋玻片的那一面。 2. 一抗的濃度需要經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索確定。 3. 第四步中如果用22×22 mm 蓋玻片，則在蓋玻片上加30 ul 稀釋的抗體，并且將蓋玻片倒置在玻璃載玻片上，然后將載玻片放到濕盒里，在室溫溫育 |
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