一、原理與方法

PPO催化各種酚與O2氧化為醌。本實(shí)驗(yàn)是采用鄰苯二酚為底物，在0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液PH5.8的反應(yīng)體系中，PPO催化鄰苯二酚形成褐色的醌，在分光光度計(jì)410nm處使反應(yīng)體系的OD值產(chǎn)生變化，通過(guò)OD值上升的讀數(shù)變化確定PPO的酶活大小。

其方法是：在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液試管中加入0.05ml0.05M鄰苯二酚溶液，在30℃恒溫水浴中預(yù)熱后加入0.05ml酶液，反應(yīng)5分鐘，在分光光度計(jì)410nm處讀取吸光值。在上述條件下，以A410讀數(shù)，以每分鐘增加0.01O.D.值定義為一個(gè)酶活性單位（U）。

二、儀器與試劑

（1）樣品：

多酚氧化酶粗酶液

硫酸銨沉淀組分

DE-52洗脫組分

葡聚糖凝膠洗脫組分

（2）底物：

鄰苯二酚：O.01M鄰苯二酚溶液

（3）反應(yīng)體系：

0.2M鄰酸二氫鈉－0.1M檸檬酸緩沖液PH5.8

（4）器皿與儀器：

試管、恒溫水浴等

分光光度計(jì)

三、酶蛋白的比活性

比活性＝酶活單位（U）/mg蛋白質(zhì)

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

1. Sephadex G-200的洗脫組分的相對(duì)濃度（OD590）和相對(duì)酶活（OD410）

結(jié)果列表

試管號(hào) 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活 試管號(hào) 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活

空白 0 0 3 0.16 0.09

粗酶液 0.20 0.14 4 0.03 0.03

1 0.00 0.01 5 0.03 0.01

2 0.13 0.09 6 0.02 0.02

分析:2和3試管中含絕大部分所需蛋白,保存進(jìn)行下一步純化。

2. DE-52的洗脫組分的相對(duì)濃度（OD590）和相對(duì)酶活（OD410）

結(jié)果列表

試管號(hào) 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活 試管號(hào) 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活

空白 0 0 3 0.03 0.05

粗酶液 0.22 0.16 4 0.09 0.05

1 0.00 0.00 5 0.07 0.02

2 0.03 0.02 6 0.03 0.00

分析:酶活性高低不一定與蛋白含量高低成正比,3和4試管中含較多所需蛋白