貼塊法適用于內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)量低的、管徑較小血管的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，其方法較酶消化法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)。但缺點(diǎn)使易混有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，前者的貼壁時(shí)間和內(nèi)皮接近，后者貼壁較內(nèi)皮慢，而且會(huì)被肝素所抑制。

雄性Wistar大鼠

DMEM 胎牛血清 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 肝素鈉 青鏈霉素 明膠 胰蛋白酶 PBS D-Hanks’液

手術(shù)器械 眼科剪 眼科鑷 培養(yǎng)皿 手術(shù)刀 培養(yǎng)瓶 CO2培養(yǎng)箱

一、實(shí)驗(yàn)方法
1. 頸椎脫臼處死大鼠，將整個(gè)大鼠浸泡于75%乙醇中消毒約1  min。在無(wú)菌狀態(tài)下，逐層剪開胸腔，分離取出主動(dòng)脈，放含無(wú)菌 D-Hanks’液培養(yǎng)皿中。

2. 用眼科剪、鑷盡量去除血管外膜的脂肪和纖維組織。然后，用含抗生素的D-Hanks’液沖洗血管的外表面及血管腔內(nèi)的凝血數(shù)次，再放入另一無(wú)菌培養(yǎng)皿中。

3. 用眼科剪縱向剪開血管，平展在培養(yǎng)皿中。用非常銳利的手術(shù)刀將其切成1 mm³ 大小的動(dòng)脈植 塊(或者用剪刀剪，依照個(gè)人習(xí)慣)，然后種植到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿(培養(yǎng)瓶或皿用1%明膠預(yù)置 37℃下過(guò)， 使用前2  h 移入CO₂培養(yǎng)箱中。用時(shí)可以先經(jīng)含 10%小牛血清的培養(yǎng)液沖洗)。將動(dòng)脈植塊的內(nèi)膜面與瓶底接觸，種植密度約為 1 塊/cm² 。

4. 置培養(yǎng)箱中靜置2 h(干貼壁)。然后，加入0.5 ml 含 25%胎牛血清的培養(yǎng)液，液量以略蓋過(guò)動(dòng)脈植塊內(nèi)膜面，而又不使植塊漂浮為宜。24 h 后，更換培養(yǎng)液，加入 2-3 ml 培養(yǎng)液。

5. 72 h 左右的時(shí)候，當(dāng)觀察到內(nèi)皮細(xì)胞充分長(zhǎng)出，而成纖維細(xì)胞剛要長(zhǎng)出的時(shí)候，將動(dòng)脈植塊除去，刮除成纖維細(xì)胞，換培養(yǎng)液1 次。以后每2 天換液一次，每次換1/2~1/3 的液量。繼續(xù)培養(yǎng) 8-10 d， 細(xì)胞融合成單層，即可傳代。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

植塊培養(yǎng)法進(jìn)行的原代培養(yǎng)，一般在培養(yǎng)2-3 天，動(dòng)脈植塊周圍即有細(xì)胞生長(zhǎng)，并漸向外延伸，呈扁平短梭形或多角形；約8-10 d 后細(xì)胞融合成片。采用vWF 免疫組化鑒定，主要表達(dá)在細(xì)胞漿中。

一、實(shí)驗(yàn)討論

植塊培養(yǎng)法適用于內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)量低的、管徑較小血管的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，其方法較酶消化法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)。但缺點(diǎn)使易混有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，前者的貼壁時(shí)間和內(nèi)皮接近，后者貼壁較內(nèi)皮慢，而且會(huì)被肝素所抑制。

而由于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)較快，隨著傳代次數(shù)越多，其污染的程度越重，從而使培養(yǎng)失敗。因而，抑制和減少成纖維細(xì)胞是大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵問(wèn)題。本法采用的方法是：

   
1. 在合適的時(shí)間去除動(dòng)脈塊，即當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)爬出，初具規(guī)模時(shí)(大概在72 h 左右的時(shí)候，按照本文的培養(yǎng)液條件，因?yàn)橛猩L(zhǎng)因子，內(nèi)皮容易爬出和增殖)，去除動(dòng)脈塊，并刮除成纖維細(xì)胞。

 
2. 使用含肝素的培養(yǎng)液(在培養(yǎng)液中加入100 U/ml 的肝素)，可使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高；

   
3. 高濃度的血清和50 µg/ml ECGF 可以充分地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而使內(nèi)皮細(xì)胞成為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞。另外，動(dòng)脈植塊干貼壁的時(shí)間不宜超過(guò)2 h，而加培養(yǎng)液這一步驟尤為關(guān)鍵，過(guò)少會(huì)使內(nèi)膜接觸不到培養(yǎng)液，過(guò)多則易使動(dòng)脈小塊漂浮，導(dǎo)致貼壁失敗。因此，干貼壁后加培養(yǎng)液，加入少量高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液(0.5-1 ml)，可以避免這些問(wèn)題。

組織塊貼塊的時(shí)候，不可避免會(huì)有一些塊貼的方向不是內(nèi)膜面，那么zui后將爬不出內(nèi)皮，甚至長(zhǎng)出較多雜質(zhì)細(xì)胞，需刮除。

另外，部分塊即使大小合適，方向也正確，也可能爬不出來(lái)，去除組織塊的時(shí)候，應(yīng)該以大局為重，看到內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)爬出較多，而雜質(zhì)細(xì)胞也開始爬出的時(shí)候，就要果斷地去除組織塊了。72 h 只是個(gè)大概的時(shí)間，初學(xué)者不可以拘泥。