酶標(biāo)記物包括酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體和酶標(biāo)記SPA等。酶標(biāo)記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱為關(guān)鍵的試劑。酶標(biāo)記物中zui常用的是酶標(biāo)記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成。酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質(zhì)量的酶(如辣根過氧化物酶，簡稱HRP)國內(nèi)已有商品供應(yīng)。高質(zhì)量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡便易行的方法。

HRP標(biāo)記抗體的方法--簡易過碘酸鈉法

1.　原理：經(jīng)典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO４氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進(jìn)一步用NaBH４(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。

2.　標(biāo)記步驟:

　　(1)　稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。

　　(2)　于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。

　　(3)　將上述溶液裝入透析袋中，對1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜。

　　(4)　加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG(抗體，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。

　　(5)　加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混勻，再置4℃2小時。

　　(6)　將上述液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4 PBS透析，4℃過夜。

　　其余步驟(純化)同戊二醛標(biāo)記步驟的(6)、(7)、(8)。

3.　結(jié)果判定：

　　除標(biāo)記物IgG量的計算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。

　　IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62

4.　試劑及器材:

　　(1)　0.1M NaIO４：稱取241mg高碘酸鈉(廣州化學(xué)試劑廠，批號830602)溶于蒸餾水10ml中。

　　(2)　1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液:

　　0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml

　　0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml

　　加蒸餾水至2,000ml。

　　(3)　0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液:

　　　　　　　Na２CO３ 0.32克

　　　　　　　NaHCO３ 0.586克

　　　　　　　加蒸餾水至50ml

　　再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。

　　(4)　NaBH４溶液(4mg／ml):

　　臨用時稱取NaBH４4mg溶于1ml蒸餾水中。