CHO 細胞無血清培養(yǎng)方法

1 CHO細胞

CHO細胞是中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用較多的是CHO-K1細胞，為轉(zhuǎn)化細胞系，細胞染色體分布頻率是2n＝22，系亞二倍體細胞。ATCC保存CHO-K1細胞株，編號為CCL-61，被廣泛地用于重組DNA蛋白的表達。由于該細胞存在遺傳缺陷，無脯氨酸合成基因，不能將谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>谷氨酸-γ-半醛，培養(yǎng)過程中需在培養(yǎng)基中添加L-脯氨酸才能生長。并且由于該細胞已經(jīng)霍亂毒素適應(yīng)，形態(tài)學(xué)有所改變。zui初細胞為貼壁型細胞，經(jīng)多次傳代篩選后，也可懸浮生長。

   CHO細胞容易發(fā)生基因突變，也較易進行基因轉(zhuǎn)染，是良好的哺乳動物基因表達宿主細胞，代表性細胞有二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase）營養(yǎng)缺陷型突變細胞株（CHO/dhfr^-）、轉(zhuǎn)染谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）基因的GS-CHO細胞。

二氫葉酸還原酶是真核細胞核苷酸生物合成過程中起著重要作用的一種酶，是常用的遺傳選擇標(biāo)記之一，它可催化二氫葉酸還原成四氫葉酸。對于dhfr突變體細胞而言，由于不能夠合成四氫葉酸，阻斷了正常核酸代謝途徑，因此不能在常規(guī)培養(yǎng)基上生長，但若在培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤（hypoxanthine）和胸苷（thymidine），則突變體細胞可以借助核苷酸的補救合成途徑維持生長。利用dhfr基因進行篩選時，首先將重組DNA分子導(dǎo)入dhfr^- 表型的受體細胞，然后撤除原培養(yǎng)基中的的次黃嘌呤和胸苷，即可獲得dhfr⁺并能表達外源基因的克隆細胞系。因此在挑選表達外源基因的陽性克隆細胞時需選用不含次黃嘌呤和胸苷的培養(yǎng)基。另外，氨甲喋呤（MTX）選擇壓力可使CHO/dhfr^- 細胞的外源基因的拷貝數(shù)擴增并得到較高水平的表達。

CHO-GS細胞是用含單抗蛋白等的目的基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因標(biāo)記的表達載體，轉(zhuǎn)染宿主細胞CHO，再通過L-氨基亞砜蛋氨酸(methionine sulphoximine，MSX)等化合物選擇加壓促使GS基因和目的蛋白基因擴增，篩選獲得重組細胞株，可在不含谷氨酰胺培養(yǎng)基中生長、增殖，可避免或減少細胞代謝過程中谷氨酰胺降解積累的氨對細胞的損傷、抑制作用。

2 CHO細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)勢與特點

由于哺乳動物細胞結(jié)構(gòu)、功能和基因表達調(diào)控的復(fù)雜性，外源基因在哺乳動物細胞中的表達與在原核生物中的表達存在較大差異，因而外源基因在哺乳動物細胞中表達所需的元件也不同于在原核生物細胞中的表達所需的元件。外源基因在哺乳動物細胞中的表達包括基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯及翻譯后蛋白質(zhì)的加工等過程，如蛋白質(zhì)的糖基化、磷酸化、寡聚體的形成以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵的形成等比較復(fù)雜，要表達具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)如膜蛋白、抗體和具有特異性催化功能的酶需要在哺乳動物細胞中進行。

哺乳動物基因表達宿主細胞選擇的基本原則是來源豐富、轉(zhuǎn)化效率高、表達效果好，CHO細胞作為表達系統(tǒng)除具有上述的特點要求外，還有以下優(yōu)勢：
1）外源基因被整合到宿主染色體上后，在沒有選擇壓力的情況下能穩(wěn)定保持；
2）適合多種蛋白質(zhì)的分泌表達和胞內(nèi)表達，并且很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，便于下游產(chǎn)物分離純化；
3）對培養(yǎng)基的要求較低，可在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
4）細胞可進行貼壁培養(yǎng)也可進行懸浮培養(yǎng)，且具有較高的耐受剪切力和滲透壓能力；
5）可進行高密度大量培養(yǎng)，進行較大規(guī)模生產(chǎn)時其培養(yǎng)量可放大到20000L以上，是目前應(yīng)用zui廣泛的哺乳動物基因表達受體細胞之一。

另有研究者嘗試將類胰島素生長因子IGF基因和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入CHO細胞獲得能自身分泌必需蛋白的“超級CHO”，無需在培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素，細胞可在無血清培養(yǎng)基（SFM）中生長良好。

3 CHO細胞在生物制藥中的應(yīng)用

目前已有多種外源基因如人組織性纖溶酶原激活劑（tPA）、人促紅細胞生成素（EPO）、乙肝表面抗原（HBsAg）、干擾素γ（IFNγ）、干擾素β（IFNβ）、白細胞介素2（IL2）、凝血因子Ⅷ等在CHO細胞中得到表達。在美國已注冊的大約73種蛋白藥物生產(chǎn)中，應(yīng)用哺乳動物細胞培養(yǎng)的有35種，CHO細胞培養(yǎng)的就占27種，其中包括10種單克隆抗體。下表是以CHO細胞培養(yǎng)為基質(zhì)生產(chǎn)的重組制品。

4 無血清細胞培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基的出現(xiàn)是培養(yǎng)基發(fā)展歷程上的一個里程碑，其一般是在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，引入成分*明確的或部分明確的血清替代成分，使培養(yǎng)基能滿足動物細胞培養(yǎng)的要求，又可有效的克服因使用血清所引發(fā)的問題。進入20 世紀80 年代后，新的無血清培養(yǎng)基不斷問世，人們經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，只要在培養(yǎng)基中增加某些適于細胞生長的成分，如纖連蛋白（fibronectin）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin, TRF）、胰島素（Insulin）和表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）等，不少細胞即能在無血清供應(yīng)的情況下生長，尤其是CHO、雜交瘤、骨髓瘤細胞以及BHK21 細胞等。某些細胞在無血清的條件下，其生長和抗體的產(chǎn)量甚至較有血清培養(yǎng)時高出數(shù)倍。

目前，無血清培養(yǎng)基的研究有兩個方向：一是培養(yǎng)基中不含有任何動物來源的添加組分；二是培養(yǎng)基中不含有不明確的添加組分。依此可以將當(dāng)前應(yīng)用較多的無血清培養(yǎng)基歸納為以下四種：

(1)無血清培養(yǎng)基，為一般意義上無血清培養(yǎng)基，用各類可替代血清功能的生物材料配制細胞培養(yǎng)基，如牛血清白蛋白(BSA) 、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等生物大分子物質(zhì)，以及從血清中提取的去除蛋白質(zhì)的混合脂類以及水解蛋白等。其特點是培養(yǎng)基中的蛋白含量較高,添加物質(zhì)的化學(xué)成分不明確，其中含有大量的動物來源蛋白。

(2)無動物來源培養(yǎng)基，許多商業(yè)公司開發(fā)的無動物來源培養(yǎng)基是基于生產(chǎn)重組藥物的安全考慮，培養(yǎng)基中的添加組分無動物來源，需要的蛋白來源于重組蛋白或者蛋白水解物，這些組分可以保障細胞生長及增殖的需要。

(3)無動物蛋白培養(yǎng)基，培養(yǎng)基*不用動物來源的蛋白，但仍有部分添加物是來源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此類培養(yǎng)基組分相對穩(wěn)定，但必須添加類固醇激素和脂類前體，并且對培養(yǎng)的細胞是高度特異性的。

(4)化學(xué)組分限定培養(yǎng)基，此類培養(yǎng)基是目前zui安全、zui為理想的培養(yǎng)基，首先可以保證培養(yǎng)基批次間的一致性，其中所添加的少量動物來源的蛋白水解物、蛋白都是成分明確的組份。其特點是培養(yǎng)基的性質(zhì)明確，有利于進行細胞培養(yǎng)的代謝研究，同時分離純化也比較方便。

研究者對CHO細胞無血清培養(yǎng)基的開發(fā)比較深入，目前有多種用于CHO細胞無血清培養(yǎng)的培養(yǎng)基面世，形成了很多固定的商業(yè)配方，這些配方有的是保護的，有的是商業(yè)秘密。國外有部分的無血清培養(yǎng)基，但價格昂貴。

CHO細胞存在多種克隆細胞系，僅ATCC保存的CHO細胞就多達38種，再加上各公司或研究單位構(gòu)建的細胞，其克隆細胞數(shù)量遠不止這些。對于CHO細胞無血清培養(yǎng)而言，由于構(gòu)建的各種高性能CHO細胞系不同，不同克隆細胞的營養(yǎng)要求也都非常的不同，對營養(yǎng)要求往往是個性化的。另外，CHO細胞培養(yǎng)過程的不同培養(yǎng)階段、重組CHO細胞構(gòu)建的各個階段，細胞代謝所需的營養(yǎng)或限制因素也是不同的，即同一細胞系在整個培養(yǎng)過程也需要使用不同的培養(yǎng)基，需要與之相對應(yīng)的個性化培養(yǎng)基（Customed Cell Culture Medium）。

5 CHO細胞無血清無動物組分培養(yǎng)基（SAF-CHO-G-004）

其實個性化培養(yǎng)基并不新鮮，在國外生物制藥企業(yè)普遍采用個性化培養(yǎng)基，世界的生物制藥公司（如Amgen、Genetech）往往和培養(yǎng)基企業(yè)合作，通過細胞培養(yǎng)基的客戶定制方式，研制自身細胞特點的個性化細胞培養(yǎng)基應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，用于提高細胞產(chǎn)率和生產(chǎn)效率。另有數(shù)據(jù)顯示，上的細胞培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)，個性化、定制培養(yǎng)基占其培養(yǎng)基業(yè)務(wù)的90%以上，目錄培養(yǎng)基不足10%。

北京清大天一生物技術(shù)有限公司依托于在細胞培養(yǎng)基研發(fā)和動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方面具有豐富經(jīng)驗的研發(fā)團隊，潛心研究，開發(fā)研制了多種個性化培養(yǎng)基，通過在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用已取得可喜的成果，如CHO細胞無血清無動物組分細胞培養(yǎng)基（SAF-CHO-G-004）就是其中之一。

5.1 CHO細胞無血清無動物組分培養(yǎng)基（SAF-CHO-G-004）的特點

SAF-CHO-G-004（代碼：SAF108）是北京清大天一生物技術(shù)有限公司開發(fā)的新一代CHO細胞無血清無動物組分細胞培養(yǎng)基，能支持多種CHO細胞的生長維持，可廣泛應(yīng)用于CHO細胞的無血清懸浮培養(yǎng)及抗體、重組蛋白的生產(chǎn)過程。細胞培養(yǎng)基產(chǎn)品的生產(chǎn)、檢驗嚴格執(zhí)行GMP管理和ISO9001管理體系，符合生物制藥原輔料要求，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。

1）SAF-CHO-G-004細胞培養(yǎng)基系無血清無動物組分培養(yǎng)基，不含有血清替代物、動物來源蛋白等動物來源組分，化學(xué)成分明確，保證了細胞培養(yǎng)中原輔料的使用安全性；

2）SAF-CHO-G-004細胞培養(yǎng)基能支持多種CHO細胞的生長、維持，具有較為廣泛的適用性；

3）適用于實驗研究和大規(guī)模培養(yǎng)應(yīng)用；

4）根據(jù)用戶的不同使用，可定制SAF-CHO-G-004培養(yǎng)基，以滿足CHO/dhfr^-、GS-CHO等不同系統(tǒng)的應(yīng)用需求；

5）有多種包裝規(guī)格可供選擇，滿足不同用戶的使用需求。

5.2CHO細胞無血清馴化

在含血清培養(yǎng)基中生長的CHO細胞可經(jīng)過一定的細胞馴化過程，適應(yīng)SAF-CHO-G-004細胞培養(yǎng)基，進行細胞的無血清培養(yǎng)。已經(jīng)適應(yīng)無血清培養(yǎng)的CHO細胞可直接在SAF-CHO-G-004中實現(xiàn)無血清培養(yǎng)培養(yǎng)，建議前二代的細胞密度不低于4×10⁵cells/ml。

細胞的無血清馴化過程如下：

1. 取處于對數(shù)生長期的貼壁CHO細胞，活率大于95%，開始進行無血清馴化。
2. 細胞馴化可以在方瓶（T-flask）、搖瓶（shake-flask）或轉(zhuǎn)瓶（spinner-bottle）中進行。
3. 將無血清細胞培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基的按1：1（V/V）的比例進行混合，接種密度為2－4×10⁵cells/ml的細胞，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。
4. 根據(jù)細胞生長和活率情況，在降血清的每一階段可穩(wěn)定傳代1－3代，接種密度維持在2- 4×10⁵cells/ml。
5. 逐步提高無血清細胞培養(yǎng)基在混合液中的比例（V/V），即降低混合液中的血清含量，傳代過程的細胞接種密度仍維持為2- 4×10⁵cells/ml。
6. 直至混合液中的血清濃度降低至0.1-0.2%，每一代的細胞活率大于90％后，此時可將細胞*培養(yǎng)在CHO無血清無動物組分培養(yǎng)基中。

在CHO無血清無動物組分培養(yǎng)基中進行放大培養(yǎng)，建立起適應(yīng)無血清無動物組分培養(yǎng)的CHO種子細胞庫。

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