問題

可能原因

解決方法

無產(chǎn)物或產(chǎn)量低

模板濃度偏低或偏高

電泳檢測模板濃度，調(diào)整模板用量

模板降解

重新制備；基因組DNA、cDNA應(yīng)小量分裝后低溫保存

模板中含有抑制反應(yīng)的雜質(zhì)

純化模板

引物濃度不足

調(diào)整引物濃度，特別是針對長片段PCR

引物存在二級結(jié)構(gòu)

重新設(shè)計引物，避免二級結(jié)構(gòu)；優(yōu)化退火溫度

引物降解

引物應(yīng)高濃度小量分裝，-20℃保存，避免反復凍融

Mg²⁺濃度偏低

適當提高Mg²⁺濃度，從1 mM到3 mM以0.5 mM間隔遞增，針對不同模板和引物摸索佳Mg²⁺濃度

dNTP降解

-20℃保存，小量分裝，避免反復凍融

酶純度低，擴增效率差

選用高質(zhì)量DNA聚合酶

酶量不足

適當增加酶量

用酶不當

針對模板、目標片段的特選擇適當?shù)拿?詳見PCR產(chǎn)品選擇指南)

緩沖液失效

更換緩沖液或使用預混PCR反應(yīng)體系

模板變性不充分

適當延長變性時間；對高GC或復雜結(jié)構(gòu)模板，提高起始變性溫度至98℃

退火溫度偏高

降低退火溫度，應(yīng)比引物Tm低至少5℃

延伸時間不足

增加延伸時間，特別是針對長片段PCR

循環(huán)數(shù)目不夠

增加循環(huán)數(shù)

PCR管污染

質(zhì)量可靠的PCR管通常不需滅菌，否則應(yīng)先高溫高壓滅菌處理；用過的PCR管不可清洗后重復使用

PCR儀故障

檢查程序和模塊溫度

其他

使用PCR增強劑

非特異產(chǎn)物過多

體系污染

設(shè)計對照實驗尋找污染源，操作時應(yīng)注意避免交叉污染

引物濃度過高

適當減少引物濃度

引物序列特異性差

重新設(shè)計引物

Mg²⁺濃度過高

降低Mg²⁺濃度，從1 mM到3 mM以0.5 mM間隔遞增，針對不同模板和引物摸索佳Mg²⁺濃度

dNTP濃度過高

降低dNTP濃度

酶量過多

減少酶量，以0.5 U間隔遞減

退火溫度過低

提高退火溫度

延伸時間過短

增加延伸時間，以1 min間隔遞增

循環(huán)次數(shù)過多

減少循環(huán)次數(shù)

模板結(jié)構(gòu)過于復雜或目標片段過長

特選擇適當?shù)拿?詳見PCR產(chǎn)品選擇指南)；使用PCR增強劑

其他

HotStart PCR

TouchDown PCR

巢式PCR

引物二聚體

引物3’末端存在互補序列

重新設(shè)計引物

引物濃度過高

降低引物濃度

模板濃度過低

提高模板濃度

退火溫度不合適

優(yōu)化退火溫度

循環(huán)次數(shù)過多

減少循環(huán)次數(shù)

其他

HotStart PCR

拖尾嚴重

引物濃度過高

調(diào)整引物濃度

引物序列特異性差或模板上存在同源序列

重新設(shè)計引物

模板降解

重新制備模板

模板濃度過高

降低模板濃度

dNTP濃度過高

減少dNTP用量

Mg²⁺濃度過高

降低Mg²⁺濃度，從1 mM到3 mM以0.5 mM間隔遞增，針對不同模板和引物摸索佳Mg²⁺濃度

酶量過多或質(zhì)量差

減少酶量，以0.5 U間隔遞減；更換質(zhì)量可靠的酶

變性溫度過低

提高變性溫度，以0.5℃遞增

退火溫度過低

提高退火溫度

延伸時間過長

縮短延伸時間

循環(huán)次數(shù)過多

減少循環(huán)次數(shù)，以2個循環(huán)間隔遞減

體系污染

設(shè)計對照實驗，消除污染源

其他

HotStart PCR

TouchDown PCR

巢式PCR

假陽性

目標片段與非特異擴增片段間存在同源性

設(shè)計陰性對照，確認為引物問題后重新設(shè)計引物

體系污染

設(shè)計陰性對照判斷是否有污染，去除污染源